氣道重塑大鼠模型的研究現(xiàn)狀

劉 波，石紹順

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，沈陽 110034)

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綜 述

氣道重塑大鼠模型的研究現(xiàn)狀

劉 波1，石紹順2*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，沈陽 110034)

篩選30余篇可信度高的關(guān)于氣道重塑大鼠模型建立的實(shí)驗(yàn)研究類論文，總結(jié)出復(fù)制支氣管哮喘氣道重塑動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀：品系選擇上，SD大鼠、Wistar大鼠和BN大鼠等較小鼠更有優(yōu)勢(shì)，近年來SD大鼠在國(guó)內(nèi)被較多采用。國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)查閱中發(fā)現(xiàn)SD大鼠的應(yīng)用率占56%。對(duì)于SD大鼠體質(zhì)量和鼠齡的選用，體質(zhì)量一般為180 g左右,4～6周齡，致敏原的選擇及激發(fā)方式以用卵蛋白(OVA)加用免疫佐劑，腹腔注射和皮下注射聯(lián)合致敏的途徑為優(yōu)。

支氣管哮喘;氣道重塑;大鼠模型

支氣管哮喘是世界上最常見的慢性疾病之一，全球約有3億哮喘患者，我國(guó)哮喘患病率約為0．5%～5%，且呈逐年上升趨勢(shì)，已成為全球哮喘病死率最高的國(guó)家之一[1-2]。本病病因多樣，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。近年來，大量病理研究[3]顯示，慢性持續(xù)性支氣管哮喘除了存在氣道炎癥和非特異性氣道高反應(yīng)性外，亦存在特征性的氣道結(jié)構(gòu)改變。氣道重塑的病理改變具有明顯的氣道炎癥，細(xì)胞呈團(tuán)狀聚集，以淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞為主，上皮細(xì)胞增生，呈指狀突起，平滑肌肌層增厚，結(jié)締組織增生，氣道周圍有大量膠原纖維沉積，杯狀細(xì)胞分泌黏液增加等，被認(rèn)為是造成難治性哮喘的根本原因。哮喘患者氣道炎癥伴隨著氣道結(jié)構(gòu)改變，即氣道重塑。氣道重塑的概念[4]是由 HUBER和KOESSLER兩位學(xué)者于1922年首先提出的，其定義主要是病理組織學(xué)描述，表現(xiàn)為氣道上皮細(xì)胞黏液化生、平滑肌肥大/增生、上皮下膠原沉積和纖維化、血管增生等[1]。近年來隨著工業(yè)化的進(jìn)程加快和環(huán)境的污染，哮喘的發(fā)病率和病死率呈全球性增高，再次引起醫(yī)學(xué)工作者的重視，各種支氣管哮喘氣道重塑的動(dòng)物模型也成為研究的熱點(diǎn)。

1 動(dòng)物選擇

1．1 品系選擇 常用的小鼠品系有BALB/c,C57BL/6,A/J等，已制備出反映氣道慢性炎癥過程的氣道重塑模型。姜愛英等[5]利用小鼠模型,可觀察血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑SU5614對(duì)模型小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)VEGF的表達(dá)情況、肺組織病理學(xué)變化,氣道反應(yīng)性和氣道血漿滲出的變化，最近有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)用BALB/c ，C57BL/6系制作的哮喘模型，其炎癥反應(yīng)無明顯差別[6]。但是小鼠模型的缺點(diǎn)是體積小，操作及取材較困難，且其制作往往需要多次致敏和激發(fā)。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)不同品系的鼠類對(duì)致敏原的反應(yīng)有差異。國(guó)外關(guān)于哮喘研究的論文多采用BN大鼠，該品系模型在特異性抗體的產(chǎn)生及誘發(fā)哮喘癥狀上優(yōu)勢(shì)明顯，尤其容易引起IgE介導(dǎo)早期反應(yīng)以及 Th2 的優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答[7]。主動(dòng)致敏處于麻醉狀態(tài)下的BN大鼠，霧化吸入卵白蛋白可誘發(fā)遲發(fā)性支氣管痙攣[8]。但BN大鼠價(jià)格較昂貴且獲取較困難，在國(guó)內(nèi)應(yīng)用較少。國(guó)內(nèi)多使用SD大鼠或Wistar大鼠[9-10]。在國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)查閱中發(fā)現(xiàn)SD大鼠的應(yīng)用率占56%，Wistar大鼠的應(yīng)用率占20%。

1．2 體質(zhì)量、鼠齡差異 PALMANS等[11]選用雄性BN大鼠質(zhì)量為250～350 g，2～5月齡。汪辰吟等[12]選用Wistar大鼠雄性180～220 g，李霞等[13]選用Wistar大鼠雄性(200～250 g)與雌性(170～250 g)1∶2配比所育，離乳21 d的子代鼠。對(duì)于SD大鼠體質(zhì)量和鼠齡的選用，體質(zhì)量約為180 g,4～6周齡。其中最小體質(zhì)量為30 g[14],最大體質(zhì)量為250 g[15]。李錚等[16]選用雄性SD大鼠體質(zhì)量為120～160 g，4～6周齡。單麗囡等[17]選用雄性SD大鼠體質(zhì)量為160～200 g，6～8周齡。龍懷聰?shù)萚15]選用雄性SD大鼠200～250 g。

2 模型制作

2．1 致敏原的選擇 姜愛英等[5]采用甲苯二異氰酸酯(TDI)誘導(dǎo)哮喘模型，另有選擇磷酸組胺作為過敏性哮喘造模劑，但需要經(jīng)過一定時(shí)間的潛伏期才會(huì)誘發(fā)哮喘反應(yīng)。病毒、真菌、細(xì)菌等上呼吸道病原體感染后也可激發(fā)呼吸道高反應(yīng)，所以也有一些研究者采用這些病原體作為造模劑,但是穩(wěn)定性欠佳。目前卵蛋白(OVA)以免疫原性強(qiáng)、來源容易、價(jià)格低廉的優(yōu)勢(shì)成為目前哮喘動(dòng)物模型中使用最廣泛的致敏原[18-20]。分為單純OVA和復(fù)合OVA(含佐劑)2種。因佐劑(氫氧化鋁、滅活百日咳桿菌、內(nèi)毒素)具有在局部產(chǎn)生炎癥反應(yīng),有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答,易導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生反應(yīng)[21]，有防止脫敏現(xiàn)象的發(fā)生的特點(diǎn)，故同時(shí)加用免疫佐劑。

2．2 致敏及激發(fā)的方式和時(shí)間 國(guó)外學(xué)者[22-23]在大鼠皮下植入熱凝結(jié)雞卵蛋白碎片使其致敏，3周后靜脈內(nèi)注射熱凝結(jié)卵蛋白一次激發(fā)復(fù)制出哮喘氣道嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)和發(fā)作期氣道高反應(yīng)性模型。崔龍?zhí)O等[24]報(bào)道通過一次性腹腔注射含卵蛋白和氫氧化鋁AL(OH)3的生理鹽水，2周后頸外靜脈內(nèi)注射卵蛋白生理鹽水溶液，激發(fā)哮喘發(fā)作，以致氣道重塑。但大量臨床試驗(yàn)顯示，通過靜脈注射的激發(fā)方式，大鼠病死率較高。

隨后研究者改良激發(fā)方式，主要以吸入過敏原為主，采用霧化吸入的激發(fā)方式，發(fā)現(xiàn)大鼠病死率有所下降。呂國(guó)平等[25]報(bào)道了參照徐淑云等實(shí)驗(yàn)方法,用卵蛋白(OVA)腹腔注射致敏，后用超聲霧化吸入法激發(fā)建立哮喘大鼠模型。遲磊等[26]對(duì)哮喘動(dòng)物模型致敏原的選擇及激發(fā)方式作以改進(jìn)，主要為加大佐劑劑量、腹腔注射和皮下注射的聯(lián)合致敏途徑，用新鮮配制的OVA1 mg+氫氧化鋁200 mg+生理鹽水1 mL混懸液在大鼠兩腹股溝、腹、前足趾，共4點(diǎn)做皮下注射，每點(diǎn)0．2 mL，同時(shí)腹腔注射0．2 mL。于實(shí)驗(yàn)第15天，以1%OVA進(jìn)行多次反復(fù)霧化吸入激發(fā)。MANSOOR等[27]在之前的研究者的免疫佐劑里加入滅活百日咳桿菌，發(fā)現(xiàn)更容易誘發(fā)出大鼠的氣道炎癥以及氣道高反應(yīng)。其采用腹腔注射雞卵白蛋白(OVA)懸液(OVA+AL(OH)3+0．9%NaCl)以及6×109個(gè)熱致死百日咳桿菌致敏，從第12天起模型各組動(dòng)物開始霧化吸入相同的致敏激發(fā)哮喘大鼠。周妍等[28]于實(shí)驗(yàn)第1、8天對(duì)模型各組動(dòng)物腹腔注射雞卵白蛋白(OVA)懸液(OVA+AL(OH)3+0．9%NaCl)以及6．7×109個(gè)熱致死百日咳桿菌兩次致敏,致敏1周后,讓大鼠每日霧化吸入1%OVA生理鹽水2 mL，20 min/次,連續(xù)7 d進(jìn)行激發(fā)造模。李春雷等[29]利用SD大鼠五點(diǎn)注射卵蛋白并復(fù)加臭氧暴露可成功建立氧化應(yīng)激特征性支氣管哮喘模型。PALMANS等[11]在實(shí)驗(yàn)第1、8天通過腹腔注射含有OVA和AL(OH)3的0．9%NaCl 0．5 mL進(jìn)行系統(tǒng)致敏，其后分別以不同周長(zhǎng)為時(shí)限，每周3次霧化吸入OVA,研究表明延長(zhǎng)OVA暴露時(shí)間可以形成類似于人類支氣管哮喘中氣道重構(gòu)的改變。

3 模型成功標(biāo)準(zhǔn)

3．1 動(dòng)物表現(xiàn)形態(tài) 模型組大鼠均發(fā)生連續(xù)激發(fā)后，大鼠體質(zhì)量減輕、毛色失去光澤、反應(yīng)遲鈍。從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的外觀、體質(zhì)量、行為等方面進(jìn)行評(píng)定，模型組較正常組體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，并表現(xiàn)為呼吸氣促。嚴(yán)重者發(fā)生呼吸減慢或節(jié)律不齊、點(diǎn)頭或腹式呼吸、輕度紫紺、四肢癱軟、行動(dòng)遲滯或俯伏不動(dòng)、反應(yīng)遲鈍，豎毛、毛色失去光澤，并隨著激發(fā)次數(shù)增加癥狀逐步加重。

3．2 大鼠肺組織病理檢測(cè) 切片HE染色結(jié)果表明氣道壁周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌增厚，細(xì)胞氣道薄膜不規(guī)則增生，皺褶明顯減少，提示已發(fā)生氣道重塑。上皮細(xì)胞有不同程度壞死且有脫落，氣道杯狀細(xì)胞增生，纖維化細(xì)胞增多等重塑特征明顯加重,平滑肌細(xì)胞均有不同程度的改變，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的改變提示細(xì)胞功能的改變。“氣道壁的增厚和面積比例的改變是形態(tài)學(xué)改變的一個(gè)客觀指標(biāo)。”曾有研究發(fā)現(xiàn)，在氣道平滑肌收縮或者松馳的時(shí)候，氣道壁內(nèi)部周長(zhǎng)均保持不變，所以可作為氣道壁厚度和內(nèi)管壁的參照標(biāo)準(zhǔn)，用來反映這兩者的變化，以減少氣道狀態(tài)、管徑大小和切片等因素引起的誤差。通常采用面積與基底膜周長(zhǎng)的比值作為標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果，來反映氣道壁平滑厚度和內(nèi)管壁厚度的變化。

4 結(jié)語

迄今為止有很多種氣道重塑動(dòng)物模型的建立方法，其目的皆為尋求哮喘的發(fā)病機(jī)制，以做到治病求本，但由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，致敏動(dòng)物在短時(shí)間內(nèi)吸入高濃度變應(yīng)原所激發(fā)的反應(yīng)難以真正模擬人類在生活生產(chǎn)環(huán)境中常年累月接觸變應(yīng)原所自發(fā)形成的哮喘[30]，應(yīng)用也存在諸多不足，有待不斷完善。一個(gè)理想的動(dòng)物模型應(yīng)具備高度相似和可重復(fù)利用的特質(zhì)，只有其病變過程與病理反應(yīng)與人類具有極高的相似度，才能更好的研制出新的治療方法，才能為醫(yī)學(xué)事業(yè)做出更大的貢獻(xiàn)。研究一種能與人類哮喘病理過程完全相同的動(dòng)物模型，仍是亟待解決的重要課題。

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Airway remodeling in rats model

LIU Bo1,SHI Shaoshun2*

(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032,China；2.Second Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110034,China)

Selects more than 30 high credibility of experimental studies of airway remodeling in rats model of journals and journal articles,carries on the comprehensive analysis and evaluation,summed up the replication bronchial asthma airway remodeling,the status of study on animal models.Strain selection,SD rats and Wistar rats and BN rats have more advantages than mice,in recent years SD rats were increasingly used in domestic.Domestic literature review found that the utility ratio of SD rats was 56%.For the use of SD rat body quality and age,body quality in general is about 180 g,4-6 weeks,the trigger choice and stimulating way with egg albumin (OVA) combined with immune adjuvant,intraperitoneal injection and subcutaneous injection for optimal joint sensitization.

bronchial asthma;airway remodeling;rat model

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.071

遼寧省科技廳博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目“清肺平喘顆粒干預(yù)哮喘大鼠氣道重塑機(jī)制研究”(20141165)；遼寧省教育廳 遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目“從TGF-β1/Smads信號(hào)通路探討清肺平喘顆粒干預(yù)哮喘氣道重塑機(jī)制”(201510162000005)。

劉 波(1992-)，女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)學(xué)方向研究。

R562.25

A

2095-6258(2016)06-1303-04

2016-06-04)

*通信作者：石紹順，男，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，電話-18940158842,電子信箱-1069862422@qq.com