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      柴芪湯對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c表達(dá)的影響*

      2016-03-19 02:10:55陳麗如張立平馬麗娜阿新拜
      西部中醫(yī)藥 2016年12期
      關(guān)鍵詞:列酮羅格肝臟

      陳麗如,張立平,劉 源,聶 瑋,馬麗娜·阿新拜

      1 北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029;2 北京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)際交流與合作處

      柴芪湯對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c表達(dá)的影響*

      陳麗如1,張立平2△,劉 源1,聶 瑋1,馬麗娜·阿新拜1

      1 北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029;2 北京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)際交流與合作處

      目的:觀察柴芪湯對(duì)非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝臟固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)mRNA及蛋白表達(dá)的影響,探討其防治NAFLD的可能機(jī)制。方法:將32只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、柴芪湯組和羅格列酮組,每組8只,采用高脂高糖高鹽飲食喂養(yǎng)8周復(fù)制NAFLD模型,造模第一天開始用藥,給予柴芪湯[5.67g/(kg·d)]及羅格列酮混懸液[3 mg/(kg·d)]灌胃干預(yù),8周后檢測(cè)大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)及肝組織中TG含量;觀察肝組織病理形態(tài)改變;Western Blot測(cè)定肝SREBP-1c蛋白表達(dá);RT-PCR測(cè)定肝SREBP-1c mRNA表達(dá)。結(jié)果:模型組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平及肝組織中TG含量明顯高于正常組(P<0.05),2用藥組各項(xiàng)指標(biāo)低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但2組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2用藥組SREBP-1c mRNA及蛋白表達(dá)水平較模型組降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但2用藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:柴芪湯能夠改善NAFLD大鼠肝臟脂肪變,其干預(yù)效果與西藥羅格列酮相似,抑制SREBP-1c mRNA和蛋白表達(dá),從而降低NAFLD大鼠血清ALT、AST、TG、TC、HLD-C、LDL-C,這可能是柴芪湯治療NAFLD的機(jī)制之一。

      非酒精性脂肪肝;柴芪湯;羅格列酮;固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c

      非酒精性脂肪性肝病(NAFLD),按病理學(xué)分類可分為單純性非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪性肝硬化[1-2]。其常與肥胖、2型糖尿病、血脂紊亂同時(shí)存在,被視為代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)[3]。近年來(lái)隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變,NAFLD已經(jīng)成為現(xiàn)代社會(huì)最常見的肝病之一[4]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[5],固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)是調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝的重要核轉(zhuǎn)錄因子,同時(shí)在脂肪酸代謝中起關(guān)鍵調(diào)控作用。根據(jù)其臨床癥狀及體征,NAFLD應(yīng)當(dāng)屬中醫(yī)“肥胖”“脅痛”“積聚”“痰飲”等范疇,病因多為過(guò)食肥甘厚味,過(guò)逸少勞,情志失調(diào)等,發(fā)病機(jī)制主要為肝失疏泄,脾失健運(yùn),痰濁瘀血阻滯。肝郁脾虛是該病主要病理基礎(chǔ),本研究以高脂、高糖、高鹽飲食建立大鼠NAFLD模型,觀察具有疏肝健脾之效的柴芪湯對(duì)NAFLD大鼠肝臟SREBP-1c mRNA及蛋白表達(dá),探討柴芪湯對(duì)防治NAFLD的作用機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料 SPF級(jí)SD雄性大鼠6~8周齡,體質(zhì)量(200±20)g,共32只購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證號(hào):SCXK(京2012-0001)]。高鹽高脂高糖飼料(52.5%基礎(chǔ)飼料,10%熟豬油,10%蛋黃粉,2%膽固醇,10%奶粉,10%果糖,5%食用鹽,0.5%膽鹽)由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

      1.2 藥品、主要試劑及儀器 柴芪湯(柴胡10 g,黃芪30 g,白術(shù)10 g,枳實(shí)10 g,三七粉3 g)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院中藥房代煎制備。羅格列酮(葛蘭素史克公司生產(chǎn),規(guī)格4 mg/片,批號(hào):H20020475)。谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測(cè)試盒均購(gòu)中生北控生物科技股份有限公司,肝臟組織甘油三酯測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所,兔抗大鼠SREBP-1c多克隆抗體(Abcam,ab28481),鼠單抗β-actin(中杉金橋,TA-09),Trizol及引物均由Invitrogen公司提供,Taq酶(RR82LR)、SYBR R Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒及DNA Marker(3427Q)均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司。全自動(dòng)生化檢測(cè)儀(日立7160),灰度分析軟件:tanon公司(Gel Image System Ver 4.0),分光光度計(jì)(Therno scientific,NANODROP 2000),ABI7500熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

      1.3 實(shí)驗(yàn)方法

      1.3.1 動(dòng)物分組及給藥 將32只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組:正常組、模型組、柴芪湯組與羅格列酮組,每組8只。除正常組給予普通飼料外,其余3組均給予高鹽高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周。自造模第1天開始持續(xù)灌胃8周,柴芪湯組給予柴芪湯5.67 g/(kg·d)(按“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比值表”計(jì)算),羅格列酮組予羅格列酮混懸液3 mg/(kg·d),正常組及模型組給予10 mL/(kg·d)蒸餾水對(duì)照。

      1.3.2 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)第8周末取材,禁食不禁水12小時(shí),以10%水合氯醛溶液(4 mL/kg)腹腔注射麻醉后,于腹主動(dòng)脈取血,靜置1小時(shí),置于離心機(jī)4℃,3 000 r/min離心15分鐘,分離上層血清,分裝凍存待測(cè)。于各組大鼠肝臟最大葉距邊緣0.5 cm處,切取約1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的肝組織,置于4%多聚甲醛溶液中,待做病理學(xué)觀察。將最大葉剩余肝組織切成約0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm大小若干塊(全部過(guò)程在冰上操作),置于凍存管中,-80℃冰箱凍存待用。

      1.3.3 指標(biāo)檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、TG、TC、HDL-C、LDL-C。精確稱取一塊大鼠肝組織,按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的冰生理鹽水,制備成10%的肝組織勻漿液,在冰浴下使用超聲勻漿機(jī)勻漿5 s/次,間隔5 s,共7~8次,至勻漿液均勻無(wú)顆粒為止,3 500 r/min離心15分鐘后取上清,按試劑盒方法測(cè)定肝臟組織中TG含量。

      1.3.4 肝組織病理學(xué) 將固定好的肝組織從多聚甲醛中取出,流水過(guò)夜后脫水機(jī)梯度脫水,常規(guī)石蠟包埋,以4 μm連續(xù)切片行HE染色,光鏡下觀察大鼠肝臟脂肪變性情況。

      1.3.5 Western blot檢測(cè)SREBP-1c蛋白表達(dá) 取約200 mg的肝組織加入RIPA裂解液2 mL及20 μL PMSF,在冰浴下使用超聲勻漿機(jī)勻漿5 s/次,間隔5秒,共7~8次,至勻漿液均勻無(wú)顆粒為止。冰浴靜置1小時(shí);4℃離心,30 000 r/min,10分鐘。取中層清液(上層為油脂,下層為少許沉淀),重復(fù)離心1次。BCA法定量后,將蛋白高溫變性,行聚丙酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1.5小時(shí),將膜浸于兔抗鼠SREBP-1c抗體1∶500,4℃過(guò)夜,洗滌后加入辣根過(guò)氧化酶結(jié)合的山羊抗兔IgG液1∶20000(Jackson,111-035-003)室溫孵育1.5小時(shí),洗膜后在膜上滴加ECL發(fā)光試劑,膠片曝光顯影,對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析,利用軟件讀取積分光密度值(OD),以目的蛋白的OD值除以內(nèi)參(β-actin)條帶的OD值作為最終結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

      1.3.6 RT- PCR檢測(cè)肝組織SREBP-1c mRNA表達(dá) 從-80℃冰箱中取出肝組織,加入Trizol裂解肝組織,提取總RNA,分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度后,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的基因SREBP-1c的引物:上游5′-AGGGAGTTCTCAGATGCTCTTGGAT-3′,下游為5′-GTCTGTGCCAGTGGTGGTAGCC-3′,產(chǎn)物大小為80 bp;內(nèi)參GAPDH引物:上游為5′-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3′,下游為5′-TGTCAT-ATTTCTCGTGGTTCA-3′產(chǎn)物大小為 138 bp。用 SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus),ROX plus進(jìn)行擴(kuò)增,實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°30sec,(95℃5sec,60℃40sec)×45個(gè)循環(huán)。用ABI 7500型熒光定量PCR儀,采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

      1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料用表示,采用單因素方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 各組大鼠血清生化指標(biāo)的比較 血清ALT、AST、TG、TC、HDL-C及LDL-C模型組與正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);血清ALT、AST、TG、HDL-C及LDL-C柴芪湯組與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);血清ALT、AST、TG、TC及LDL-C羅格列酮組與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);上述指標(biāo)兩用藥組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

      表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較

      表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較

      注:#表示與正常組比較,P<0.05;*表示與模型組比較,P<0.05。

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      2.2 各組大鼠肝臟組織TG水平 大鼠肝組織中TG含量模型組、柴芪湯組、羅格列酮組與正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);柴芪湯組、羅格列酮組與模型組比較,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);兩用藥組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

      表2 各組大鼠肝臟組織TG含量mmol/L

      表2 各組大鼠肝臟組織TG含量mmol/L

      注:#表示與正常組比較,P<0.05;*表示與模型組比較,P<0.05。

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      2.3 各組大鼠肝臟組織觀察結(jié)果 光鏡下正常組肝組織結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向四周呈條索狀、放射狀整齊排列,肝細(xì)胞分界清,肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝竇排列規(guī)則,匯管區(qū)清晰。模型組大鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿大量大小不等的圓形脂滴,肝小葉結(jié)構(gòu)不清,肝索排列紊亂,大部分肝細(xì)胞呈脂肪變性。柴芪湯組大鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴較少,肝索排列較正常,肝血竇擴(kuò)張,肝細(xì)胞形態(tài)接近正常。羅格列酮組大鼠肝臟脂變程度介于模型組與柴芪湯組之間,肝細(xì)胞形態(tài)基本可見,肝細(xì)胞脂肪變性少見,可見點(diǎn)狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

      圖1 光鏡下觀察大鼠肝組織(HE,×200)

      2.4 各組SREBP-1c mRNA及蛋白的表達(dá)情況

      SREBP-1c及SREBP-1c mRNA表達(dá)模型組、柴芪湯組、羅格列酮組與正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);柴芪湯組、羅格列酮組與模型組比較,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);2用藥組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

      表3 各組大鼠肝臟SREBP-1c蛋白及其mRNA表達(dá)

      3 討論

      3.1 NAFLD的中醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí) 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為食物的消化吸收有賴于肝疏泄和脾運(yùn)化的功能正常,飲食不節(jié)、過(guò)食肥甘厚味,勞逸失?;蚯橹舅鶄?,可損傷肝脾,而致肝失疏泄,氣機(jī)阻滯,脾胃運(yùn)化失健,水谷精微不化,停聚濕生痰,痰濕阻絡(luò),血行不暢,留而為瘀,終致氣、血、濕、痰互結(jié)于肝而成脂肪肝。故肝郁脾虛是NAFLD的主要病理基礎(chǔ)。柴芪湯由黃芪、柴胡、白術(shù)、枳實(shí)、三七粉組成。方中黃芪補(bǔ)中益氣健脾,柴胡疏肝解郁,調(diào)暢氣機(jī),共為君藥;白術(shù)健脾助運(yùn),“見肝之病,知肝傳脾,當(dāng)先實(shí)脾”,故實(shí)脾以防肝乘,為臣藥;枳實(shí)理氣解郁,與柴胡共同調(diào)暢肝脾氣機(jī),為佐藥;三七化瘀止血活血為使藥。此方補(bǔ)中有疏,調(diào)中有養(yǎng),護(hù)脾治肝,使脾運(yùn)復(fù)健,肝郁得疏,標(biāo)本同治。

      3.2 柴芪湯對(duì)大鼠血清血脂及肝功能的影響 LDL-C為極低密度脂蛋白水解后除去部分脂肪及少量蛋白質(zhì)后的殘余部分,主要用于運(yùn)輸體內(nèi)膽固醇至肝臟,檢測(cè)LDL-C水平可反映肝臟膽固醇水平[6]。HDL-C主要由肝臟生成和分泌,用于將肝臟中的磷脂和膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)出去[7]。模型組血清TG、TC及LDL-C較正常組明顯升高,同時(shí)HDL-C降低,符合NAFLD病變模型。柴芪湯干預(yù)8周后,可明顯降低TG及LDL-C,并提高HDL-C含量,但對(duì)血清TC含量改善較模型改善無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。羅格列酮可降低NAFLD大鼠血清TG、TC及LDL-C含量,但對(duì)提高HDL-C無(wú)明顯效果。ALT和AST主要分布于肝及心肌細(xì)胞內(nèi),血清中含量較少,當(dāng)肝細(xì)胞膜通透性增加或嚴(yán)重受損時(shí)ALT和AST被釋放至血,血清ALT和AST水平升高[8]。因此,模型組大鼠經(jīng)喂養(yǎng)特殊飼料后發(fā)生肝臟脂肪病變時(shí)肝細(xì)胞膜通透性改變,大量細(xì)胞受損或壞死,導(dǎo)致血清ALT和AST水平升高。利用柴芪湯或羅格列酮干預(yù)后均可較模型組降低血清ALT及AST含量,且血清中該2項(xiàng)指標(biāo)與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表示柴芪湯與羅格列酮有一定保護(hù)肝臟功能的作用,且效果相當(dāng)。

      3.3 柴芪湯對(duì)肝臟組織TG影響 過(guò)量高脂飲食可使肝內(nèi)TG堆積[9],引起肝組織脂肪變性。研究結(jié)果顯示,NAFLD患者存在脂代謝紊亂[10],肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂是引起TG大量沉積于肝臟的重要原因,TG是肝細(xì)胞正常生理功能的必需物質(zhì)之一,但當(dāng)肝組織中沉積大量TG則會(huì)導(dǎo)致脂肪肝變性[11]。本研究發(fā)現(xiàn)柴芪湯及羅格列酮均可改善TG在肝組織中的沉積,兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。

      3.4 柴芪湯對(duì)肝臟SREBP-1c的影響 SREBP-s是一類分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上的膜連接蛋白,有3種同工型:SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2,嚙齒類動(dòng)物和人類的肝臟中以SREBP-1c為主,它是一類調(diào)控脂肪酸TG和TC的合成,參與LDL-C代謝相關(guān)基因表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子,上調(diào)脂肪合成基因的表達(dá),可明顯增加游離脂肪酸和TG的合成,在NAFLD的發(fā)病過(guò)程中具有重要作用[12]。

      本實(shí)驗(yàn)利用特殊飼料誘發(fā)NAFLD模型,病理形態(tài)證實(shí)模型成立,RT-PCR與Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示模型組SREBP-1c mRNA表達(dá)及蛋白含量較正常組明顯增加,與文獻(xiàn)中報(bào)道一致[13]。使用柴芪湯及羅格列酮干預(yù)后發(fā)現(xiàn)SREBP-1c mRNA表達(dá)及蛋白含量較模型組降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示柴芪湯與羅格列酮可能有相似的干預(yù)機(jī)制,均可以通過(guò)抑制SREBP-1c mRNA表達(dá)和下調(diào)SREBP-1c的表達(dá),減少脂肪酸和甘油三酯的生成,從而對(duì)NAFLD具有防治作用。

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      Effects of ChaiQi Tang on Expression of SREBP-1c in Rats with Nonalcoholic Fatty Liver Disease

      CHEN Liru1,ZHANG Liping2△,LIU Yuan1,NIE Wei1,Malina·AXINBAI1
      1 Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;
      2 International Exchange and Cooperation of Beijing University of Chinese Medicine

      Objective: To observe the effects of ChaiQi Tang on SREBP-1c mRNA and protein expression in rats with nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD) and explore the possible mechanism of preventing and treating NAFLD. Methods: All 32 male SPF rats were randomly divided into the normal group, the model group, ChaiQi Tang group and rosiglitazone group, each group eight rats, all groups were fed with high salt, high fat and high sugar diet for eight weeks for duplicating NAFLD model, the medication groups accepted gastric lavage of ChaiQi Tang [5.67 g/ (kg·d)] and rosiglitazone suspension [3 mg/(kg·d)] from the first day of preparing the models, ALT, AST, TG, TC, HDL-C, LDL-C and TG level in liver were detected after eight weeks; pathological changes of hepatic tissue were observed; SREBP-1c protein expression was measured by Western Blot; SREBP-1c mRNA expression was measured by RT-PCR. Results: The model group was higher than the normal group obviously in the levels of ALT, AST, TG, TC, HDL-C, LDL-C in serum and TG in liver(P<0.05), the two medication groups were lower than the model group in different indexes, and there were statistical differences (P<0.05); there were no statistical difference between two groups(P>0.05). Two medication groups were lower than the model group in the levels of SREBP-1c mRNA and protein expression, there were statistical differences(P<0.05), but there were no statistical differences between two medication groups(P>0.05). Conclusion: ChaiQi Tang can improve fatty change of liver in rats with NAFLD, its intervention function is similar to rosiglitazone, ChaiQi Tang also can inhibit SREBP-1c mRNA and protein expression, finally reducing ALT, AST, TG, TC, HDL-C, LDL-C of serum in rats with NAFLD, this may be one of mechanisms of ChaiQi Tang treating NAFLD.

      NAFLD; ChaiQi Tang; rosiglitazone; SREBP-1c

      R285.5

      A

      1004-6852(2016)12-0013-05

      2016-07-08

      國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)81273695);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(編號(hào)20130013110016);北京中醫(yī)藥大學(xué)在讀研究生項(xiàng)目(編號(hào)2015-JYB-XS163)。

      陳麗如(1976—),女,在讀博士研究生。研究方向:消化系統(tǒng)疾病的中醫(yī)診治。

      △通訊作者:張立平(1963—),女,博士學(xué)位,博士研究生導(dǎo)師,教授,主任醫(yī)師。研究方向:消化系統(tǒng)疾病的中醫(yī)診治。

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