乙醛法篩選抗乙醛啤酒酵母菌株的應(yīng)用研究

金瑋鋆，李　紅，王君偉(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015)

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乙醛法篩選抗乙醛啤酒酵母菌株的應(yīng)用研究

金瑋鋆，李紅，王君偉
(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015)

摘要：乙醛是使啤酒產(chǎn)生硬紙板味、爛蘋果味的主要來(lái)源，對(duì)啤酒品質(zhì)有較大影響。本實(shí)驗(yàn)采用紫外誘變與高濃乙醛平板選育結(jié)合法，將篩選得到的菌株（共20株）與出發(fā)菌株進(jìn)行低溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，然后利用氣相色譜法測(cè)定菌株發(fā)酵液乙醛含量，并將其與出發(fā)菌株乙醛含量相比較。對(duì)具有較大乙醛降幅的菌株（共3株）進(jìn)行乙醇脫氫酶活性的驗(yàn)證及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，由此篩選出抗乙醛啤酒酵母菌株。該菌株可抵抗高濃度乙醛環(huán)境，從而快速還原代謝產(chǎn)生的乙醛，其乙醛含量為4.42 mg/L±0.14 mg/L，較出發(fā)菌株降低了71.13 %；乙醇脫氫酶（ADH1、ADH3與ADH4）活性顯著高于出發(fā)菌株（增幅為88.80 %），且遺傳穩(wěn)定性表現(xiàn)良好。

關(guān)鍵詞：微生物；乙醛；抗乙醛啤酒酵母；高濃乙醛法；乙醇脫氫酶

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2015-10-22；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151022.1440.002.html。

乙醛是啤酒羰基化合物的主要成分，也是啤酒產(chǎn)生硬紙板味、爛蘋果味的主要來(lái)源，對(duì)啤酒風(fēng)味有較大的影響[1]。雖然國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4927—2008中并未對(duì)乙醛含量有所限制，但含量過(guò)高的乙醛也會(huì)影響人們對(duì)啤酒的味覺(jué)感受。當(dāng)啤酒中乙醛的含量超過(guò)25 mg/L時(shí)，就會(huì)有辛辣刺激的口感；超過(guò)10 mg/L時(shí)，啤酒會(huì)有不成熟的口感。優(yōu)質(zhì)啤酒的乙醛含量一般在3～8 mg/L[2]。

在諸多低產(chǎn)乙醛啤酒酵母菌株的選育方法中，許多研究人員選擇運(yùn)用基因工程手段構(gòu)造重組菌株的方法獲得理想的低乙醛啤酒酵母菌株[3-4]，該法雖然成功率高且效果顯著，但考慮到近年來(lái)利用基因工程重組菌株進(jìn)行啤酒釀造的安全性問(wèn)題備受爭(zhēng)議，國(guó)內(nèi)外也鮮有企業(yè)將基因工程構(gòu)造菌株應(yīng)用于啤酒工業(yè)化生產(chǎn)之中。因此，本研究摒棄了基因工程法，通過(guò)分析啤酒酵母的乙醛代謝途徑，從傳統(tǒng)誘變及選育方法出發(fā)，進(jìn)行低產(chǎn)乙醛啤酒酵母菌株的選育。

近年來(lái)也有研究人員采用相似選育方法進(jìn)行低產(chǎn)乙醛啤酒酵母的選育。張媛媛利用紫外誘變和甲吡唑抗性平板+希夫試劑顯色結(jié)合法篩選得到乙醛含量低于出發(fā)菌的突變株，其乙醛降幅達(dá)到82.0 %[5]；沈楠采用紫外誘變和乙醛脫氫酶抑制劑雙硫侖-乙醇平板篩選結(jié)合法，并配合高濃乙醛低溫馴化，得到低產(chǎn)乙醛酵母菌株，其降幅為73.7 %[6]。以上兩種方法在選育低產(chǎn)乙醛啤酒酵母菌株中具有顯著優(yōu)勢(shì)，但操作過(guò)于復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)試劑成本過(guò)高。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用紫外誘變與高濃乙醛平板選育結(jié)合法，將隨機(jī)挑選大而圓的獨(dú)立菌落進(jìn)行低溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，然后利用氣相色譜法測(cè)定實(shí)驗(yàn)菌株發(fā)酵液乙醛的含量，并將其與出發(fā)菌株乙醛含量相比較。然后，對(duì)具有較大乙醛降幅的實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行乙醇脫氫酶酶活的測(cè)定及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，由此篩選出抗乙醛啤酒酵母菌株。該菌株可抵抗高濃度乙醛環(huán)境，從而快速還原代謝產(chǎn)生的乙醛，具有低產(chǎn)乙醛的發(fā)酵特性。該方法操作簡(jiǎn)單安全，所用試劑較少，可快速、有效地篩選出抗乙醛啤酒酵母，從菌株的角度降低啤酒中乙醛的含量。

如圖1所示，丙酮酸通過(guò)丙酮酸脫羧酶（E1）積累生成乙醛；乙醇通過(guò)乙醇脫氫酶（E2）生成乙醛的反應(yīng)速率高于乙醛的還原反應(yīng)；生成的乙醛未能通過(guò)乙醛脫氫酶（E3）及時(shí)轉(zhuǎn)化成乙酸。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)向環(huán)境中添加高濃度乙醛以造成乙醛的積累，抑制酵母的生長(zhǎng)代謝活性，從而篩選E2（ADH1、ADH3、ADH4）或E3活性高的啤酒酵母菌株。

由圖1可知，E1為丙酮酸脫羧酶；E2為乙醇脫氫酶（其中乙醛生成乙醇途徑的關(guān)鍵酶為ADH1、ADH3、ADH4，乙醇生成乙醛的關(guān)鍵酶為ADH2）；E3為乙醛脫氫酶（ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6）；E4為乙酰輔酶A合成酶（ACS1、ACS2）。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1材料與試劑

菌種：實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

試劑及耗材：40 %乙醛（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂（生物試劑），北京奧博拓達(dá)科技有限公司；磷酸氫二鉀（分析純），磷酸二氫鉀（分析純），北京紅星化工廠；乙二胺四乙酸（EDTA）（生物試劑），氫氧化鉀（化學(xué)純），無(wú)水乙醇（分析純），北京化工廠；輔酶I （NAD+）（98 %分析純），還原型輔酶I（NADH）（98 %分析純），百靈威科技有限公司；甘氨酸（生物試劑），北京索萊寶科技有限公司；氯化鉀（分析純），西隴化工股份有限公司。

試劑及培養(yǎng)基配制方法如下：

2 mM EDTA：稱取0.58 g EDTA，用去離子水溶解并定容至1 L。

100 mM磷酸鉀緩沖液（pH7.5）：將80.2 mL 1 mol/L磷酸氫二鉀與19.8 mL 1 mol/L磷酸二氫鉀混勻。

50 mM甘氨酸-氫氧化鉀緩沖溶液（pH9.0）：將50 mL 0.2 mol/L甘氨酸與8.8 mL 0.2 mol/L氫氧化鉀混勻，用去離子水定容至200 mL。

100 mM乙醇：量取7.8 mL 75 %vol的乙醇溶液，用去離子水稀釋并定容至1 L。

0.15 mM乙醛：量取14.1 mL 40 %乙醛，迅速用去離子水稀釋并定容至1 L（通風(fēng)櫥操作）。

1 mM NAD+：稱取0.67 g NAD+，用去離子水溶解并定容至1 L。

1 mM NADH：稱取0.71 g NADH，用去離子水溶解并定容至1 L。

10 mM氯化鉀：稱取0.75 g氯化鉀，用去離子水溶解并定容至1 L。

麥汁培養(yǎng)基：將大麥芽粉碎，利用協(xié)定糖化法制備原麥汁濃度為13°P的定型麥芽汁，115℃下滅菌20 min。

麥汁瓊脂培養(yǎng)基：在麥汁中加入2 %瓊脂，115℃下滅菌20 min。

乙醛-麥汁瓊脂培養(yǎng)基：用移液管移取10 mL 40 %乙醛溶液于100 mL容量瓶中，迅速用蒸餾水稀釋，配制成4 %乙醛溶液，備用（由于乙醛易揮發(fā)，因此配制時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)操作）。配制麥汁瓊脂培養(yǎng)基，滅菌后向含100mL未凝固培養(yǎng)基的三角瓶中依次注射添加經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾的500 μL、1500 μL、2500 μL、3500 μL、4500 μL、5500 μL、6500 μL、7500 μL4 %乙醛溶液，立即封口并迅速混勻，配成終濃度依次為200 mg/L、600 mg/L、1000 mg/L、1400 mg/L、1800 mg/L、2200 mg/L、2600 mg/L、3000 mg/L的乙醛-麥汁瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.2儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（LRH-250），上海一恒科技有限公司；多用途恒溫超聲提取機(jī)（SY-1000E），北京弘祥隆生物技術(shù)公司；高速冷凍離心機(jī)（LR10-2.4A），北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司；紫外分光光度計(jì)（UV-1780），日本Shimadzu公司；高效氣相色譜儀（Autosystem XV），美國(guó)PE公司；高壓蒸汽滅菌鍋（LDZX-50KBS），上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1不同濃度乙醛的平板涂布

圖1酵母乙醛代謝途徑示意圖

（1）按乙醛-麥汁瓊脂培養(yǎng)基配制方法制備不同濃度乙醛-麥汁瓊脂平板，以麥汁瓊脂平板為對(duì)照，每個(gè)平板含培養(yǎng)基25 mL。

（2）取1支出發(fā)菌株（編號(hào)為KB）斜面，從斜面上接取1環(huán)酵母泥放入10 mL麥汁中28℃下活化培養(yǎng)24 h。

（3）取1 mL活化酵母液，利用梯度稀釋法稀釋至一定倍數(shù)后，分別取100 μL接到平板上涂布，每個(gè)乙醛濃度和對(duì)照組均設(shè)3個(gè)平行。

（4）將涂布好的平板（含乙醛的平板須用封口膜包好以減少乙醛的揮發(fā)）于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4～5 d，每日定時(shí)觀察菌落的生長(zhǎng)情況，計(jì)算每個(gè)平板的菌落個(gè)數(shù)，計(jì)算抑制率。

抑制率的計(jì)算公式如下：

抑制率（%）=（對(duì)照組平均菌落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)）÷對(duì)照組平均菌落數(shù)×100 %。

1.2.2紫外誘變時(shí)間的確定

（1）25 W紫外燈預(yù)熱15～20 min后，將涂布好菌懸液的平板放置在紫外燈下30 cm處，迅速打開平板蓋進(jìn)行紫外照射，紫外照射時(shí)間分別為0、5 s、10 s、15 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s，每個(gè)照射強(qiáng)度做3個(gè)平行。

（2）照射后立即關(guān)蓋，并迅速用錫紙包好避光放置，整個(gè)誘變過(guò)程須避光完成，防止菌體發(fā)生光修復(fù)。

（3）將包好的平板于28℃下避光倒置培養(yǎng)4～5 d，觀察并記錄不同照射時(shí)間下酵母菌落數(shù)，計(jì)算不同照射強(qiáng)度下酵母致死率，確定紫外誘變最佳照射時(shí)間。

致死率的計(jì)算公式如下：

致死率（%）=（對(duì)照組平均菌落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)）÷對(duì)照組平均菌落數(shù)×100 %。

1.2.3高濃乙醛篩選抗乙醛啤酒酵母

（1）制備乙醛濃度為1800 mg/L的乙醛-麥汁瓊脂平板，按平板涂布實(shí)驗(yàn)方法對(duì)酵母菌懸液進(jìn)行涂布。

（2）對(duì)涂布好的平板進(jìn)行紫外誘變的照射，照射時(shí)間為20 s，設(shè)3個(gè)平行。照射結(jié)束后用錫紙包好，于28℃下避光倒置培養(yǎng)4～5 d，觀察并記錄不同照射時(shí)間下酵母菌落數(shù)量。

（3）從平板中隨機(jī)挑選大而圓的獨(dú)立菌落酵母菌株，編號(hào)并保藏至斜面。

（4）分別從實(shí)驗(yàn)菌株和KB斜面上取1環(huán)酵母菌株（接菌量約為2.5×107cfu/mL）放入10 mL麥汁中，28℃下活化培養(yǎng)24 h。

（5）分別取1 mL活化液接入9 mL麥汁中，28℃下擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，以提高酵母菌株的活性并促使接菌量基本一致。

（6）將10 mL擴(kuò)培液分別接入100 mL麥汁中，12℃下進(jìn)行低溫發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為8～10 d。

（7）發(fā)酵結(jié)束后，取5 mL發(fā)酵液至頂空瓶中，參照《啤酒分析方法》GB 4928—2008，利用氣相色譜法（GC）對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株發(fā)酵液進(jìn)行乙醛含量的測(cè)定[7]，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)菌株的乙醛降幅與所有實(shí)驗(yàn)菌株的乙醛平均降幅。降幅及平均降幅的計(jì)算公式如下：

降幅（%）=（出發(fā)菌株乙醛含量-實(shí)驗(yàn)菌株乙醛含量）÷出發(fā)菌株乙醛含量×100 %；

平均降幅（%）=正突變菌株乙醛降幅的總和÷正突變菌株個(gè)數(shù)×100 %。

（8）根據(jù)乙醛降幅由大到小的順序?qū)?shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行排序，選取降幅較大的3株進(jìn)行乙醇脫氫酶酶活的測(cè)定。

1.2.4乙醇脫氫酶的提取及測(cè)定

1.2.4.1粗酶液的提取

（1）發(fā)酵結(jié)束后，將余下發(fā)酵液倒入50 mL離心管中（離心管須事先稱量質(zhì)量并編號(hào)），以5000×g離心5 min，棄上清液收集酵母細(xì)胞。

（2）用5 mL 2 mM EDTA和超純水分別清洗2次，每次以5000×g離心10 min。

（3）稱量含有底層酵母泥的離心管質(zhì)量以計(jì)算得到酵母泥質(zhì)量，將收集得到的酵母泥懸浮于100 mM的磷酸鉀緩沖溶液（pH 7.5）（按1∶30料液比）。

（4）采用凍融-超聲結(jié)合法對(duì)酵母懸濁液進(jìn)行破壁處理，將菌懸液冷凍于-18℃冰箱，每次至少冷凍3 h，于4℃冰箱中解凍3次。

（5）第3次解凍菌懸液后將其置于恒溫超聲提取機(jī)中，0℃下500 W超聲20 min（工作時(shí)間為3.5 s，間歇時(shí)間為1.5 s，冰浴降溫）。

（6）將超聲后的菌懸液在10℃下10000×g低溫離心10 min，吸取上清液作為細(xì)胞抽提物即粗酶液。

1.2.4.2乙醇脫氫酶酶活的測(cè)定

乙醇脫氫酶活性的測(cè)定原理為：

（1）乙醇脫氫酶ADH2酶活的測(cè)定：取2支比色管，向其中1支比色管中依次添加1.5 mL甘氨酸-氫氧化鉀緩沖液、0.5 mL NAD+、0.5 mL粗酶液作為實(shí)驗(yàn)組，另1支比色管中依次添加1.5 mL甘氨酸-氫氧化鉀緩沖液、0.5 mL NAD+、0.5 mL去離子水作為對(duì)照組。將比色管搖勻，室溫（25℃）下添加0.5 mL乙醇，快速混勻后倒入比色皿中，記錄340 nm下1 min的吸光度，并計(jì)算每分鐘吸光度增加值E340。

（2）乙醇脫氫酶ADH1酶活的測(cè)定：取2支比色管，向其中1支比色管中依次添加1.5 mL甘氨酸-氫氧化鉀緩沖液、0.5 mL NADH、0.5 mL粗酶液作為實(shí)驗(yàn)組，另1支比色管中依次添加1.5 mL甘氨酸-氫氧化鉀緩沖液、0.5 mL NADH、0.5 mL去離子水作為對(duì)照組。將比色管搖勻，室溫（25℃）下添加0.5 mL乙醛，快速混勻后倒入比色皿中，記錄340 nm下每分鐘的吸光度，并計(jì)算每分鐘吸光度增加值E340。

乙醇脫氫酶酶活定義為：3 mL反應(yīng)體系。1 min吸光度增加0.001為一個(gè)活力單位。以單位酵母質(zhì)量所有具有的酶活性值表示，單位為U/mg。

酶活計(jì)算公式如下：

U= (E340×3) / (0.5×0.001)。

式中：E340為每分鐘的吸光度增加值；3為測(cè)酶活的反應(yīng)體系的量；0.5為反應(yīng)體系添加酶液的量；0.001為吸光度增加單位。

酶活增幅的計(jì)算公式如下：

酶活增幅（%）=（實(shí)驗(yàn)菌株酶活-出發(fā)菌株酶活）÷出發(fā)菌×100 %。

1.2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1重復(fù)實(shí)驗(yàn)

選取初篩菌株與出發(fā)菌株，重復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，每株設(shè)3組平行。

1.2.5.2傳代實(shí)驗(yàn)

（1）選取初篩菌株與出發(fā)菌株斜面上取1環(huán)酵母菌株（接菌量約為2.5×107cfu/mL）放入10 mL麥汁中，28℃下活化培養(yǎng)24 h。

（2）分別取1 mL活化液接入10 mL麥汁中，28℃下擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，以提高酵母菌株的活性并促使接菌量基本一致，視此發(fā)酵液為酵母菌株的第0代發(fā)酵液。

（3）在第0代菌株發(fā)酵高泡期（即24 h后）時(shí)，從中移取1 mL發(fā)酵液，加到10 mL麥汁中，為1代菌株發(fā)酵，剩余10 mL第0代發(fā)酵液則接入100 mL麥汁中進(jìn)行12℃低溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn)；在第1代菌株發(fā)酵高泡期時(shí)，再移出1 mL發(fā)酵液加到10 mL麥汁中，為2代菌株發(fā)酵，剩余10 mL 第1代發(fā)酵液接入100 mL麥汁中進(jìn)行12℃低溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。如此反復(fù)操作步驟，連續(xù)進(jìn)行5代三角瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵時(shí)間為8～10 d。

（4）發(fā)酵結(jié)束后，取5 mL發(fā)酵液至頂空瓶中，參照《啤酒分析方法》GB 4928—2008，利用氣相色譜法（GC）對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株發(fā)酵液進(jìn)行乙醛含量的測(cè)定，計(jì)算相同菌株不同代數(shù)間的相對(duì)偏差，據(jù)此驗(yàn)證初篩菌株穩(wěn)定性。

2結(jié)果與討論

2.1乙醛抑制曲線與最佳添加濃度的確定

按照乙醛添加方法及培養(yǎng)基配制方法，分別制備濃度梯度為0 mg/L、200 mg/L、600 mg/L、1000 mg/L、1400 mg/L、1800 mg/L、2200 mg/L、2600 mg/L、3000 mg/L乙醛稀釋液的麥汁瓊脂培養(yǎng)基，并進(jìn)行平板涂布培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，對(duì)各平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)和抑制率的計(jì)算，繪制抑制曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2添加不同濃度乙醛的酵母抑制曲線

由圖2可知，隨著乙醛添加濃度的不斷升高，酵母抑制率逐漸上升，抑制曲線呈上升趨勢(shì)，當(dāng)乙醛濃度大于2600 mg/L時(shí)，酵母完全受到抑制，不再生長(zhǎng)。當(dāng)乙醛濃度為1800 mg/L時(shí)，酵母抑制濃度超過(guò)50 %，因此，選取1800 mg/L為乙醛最佳添加濃度。

2.2紫外誘變最佳時(shí)間的確定

本研究通過(guò)紫外誘變實(shí)驗(yàn)得到不同誘變時(shí)間下酵母致死率，繪制致死曲線，對(duì)紫外誘變的最佳誘變時(shí)間進(jìn)行確定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3不同紫外誘變時(shí)間下的酵母致死曲線

由圖3可知，酵母致死率隨著紫外誘變時(shí)間的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)紫外誘變時(shí)間在20 s之前時(shí)，酵母致死率較低且不穩(wěn)定；當(dāng)紫外誘變時(shí)間為20 s時(shí)，酵母致死率超過(guò)80 %；當(dāng)誘變時(shí)間為60 s以上時(shí)，酵母致死率達(dá)到100 %。因此，本實(shí)驗(yàn)選取20 s（致死率為91.58 %）作為其最佳誘變時(shí)間。

2.3抗乙醛啤酒酵母菌株的選育

選取抑制濃度為1800 mg/L乙醛進(jìn)行抗乙醛啤酒酵母菌株的選育實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中共隨機(jī)挑選了20株實(shí)驗(yàn)菌株與出發(fā)菌株（KB）一同進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定乙醛含量，并計(jì)算實(shí)驗(yàn)菌株乙醛降幅與平均降幅，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，20株實(shí)驗(yàn)菌株中共有9株乙醛含量較出發(fā)菌株（KB）有所下降，正突變率為45.00 %，平均降幅為18.39 %，最大降幅為71.40 %。

其中，乙醛降幅最高的菌株編號(hào)依次為2、12、14。

圖4高濃乙醛法篩選菌株（共20株）與出發(fā)菌株（KB）乙醛降幅

2.4初篩菌株與出發(fā)菌株乙醇脫氫酶酶活的測(cè)定

對(duì)編號(hào)為2、12、14的3株初篩菌株及KB進(jìn)行乙醇脫氫酶（分別用ADH1與ADH2表示）酶活的測(cè)定，并計(jì)算初篩菌株與KB的酶活增幅，測(cè)定及計(jì)算結(jié)果見表1。

由表1可知，3株初篩菌株乙醇脫氫酶酶活均高于出發(fā)菌株KB，將乙醛生成乙醇途徑的關(guān)鍵酶ADH1、ADH3、ADH4與乙醇生成乙醛的關(guān)鍵酶ADH2酶活增幅相比較可以看出，初篩菌株ADH1、ADH3、ADH4酶活增幅均高于ADH2酶活增幅，該現(xiàn)象表明初篩菌株乙醛生成乙醇的反應(yīng)速率大于乙醇生成乙醛的反應(yīng)速率，因而實(shí)現(xiàn)乙醛代謝速度的提升。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好地證實(shí)了初篩菌株的低產(chǎn)乙醛現(xiàn)象，也驗(yàn)證了利用高濃乙醛法選育抗乙醛啤酒酵母菌株的有效性。3組實(shí)驗(yàn)菌株中，菌株2乙醇脫氫酶ADH1、ADH3、ADH4酶活顯著高于其余實(shí)驗(yàn)菌株及對(duì)照組，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其具有最大乙醛降幅相符合。

表1初篩菌株(共3株)與出發(fā)菌株(KB)乙醇脫氫酶活性及酶活增幅對(duì)比結(jié)果

2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

對(duì)以上3株初篩菌株進(jìn)行同步發(fā)酵并測(cè)定發(fā)酵液乙醛含量，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)及傳代實(shí)驗(yàn)，其中，重復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)3組平行，傳代實(shí)驗(yàn)共傳5代。

初篩菌株與KB重復(fù)性實(shí)驗(yàn)見表2：3株初篩菌株與KB實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不超過(guò)0.20 mg/L。其中，菌株2的乙醛含量平均值最低（4.42 mg/L±0.14 mg/L），比出發(fā)菌株（KB）降低了71.13 %。初篩菌株與KB傳代實(shí)驗(yàn)見表3：菌株2、菌株12表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性，每代乙醛含量間標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于0.20 mg/L。菌株2乙醛含量的波動(dòng)范圍為4.12～4.49 mg/L。

表2初篩菌株(共3株)與出發(fā)菌株(KB)重復(fù)實(shí)驗(yàn)乙醛含量對(duì)比結(jié)果　(mg/L)

表3初篩菌株(共3株)與出發(fā)菌株(KB)傳代實(shí)驗(yàn)乙醛含量對(duì)比結(jié)果　(mg/L)

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從酵母乙醛代謝途徑出發(fā)，分析了酵母降低乙醛含量的代謝途徑，并綜合實(shí)驗(yàn)操作成效及實(shí)驗(yàn)菌株安全性，最終采用將紫外誘變育種與高濃乙醛法平板篩選法相結(jié)合的方法篩選抗乙醛啤酒酵母菌株。通過(guò)低溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn)測(cè)定乙醛含量及低乙醛實(shí)驗(yàn)菌株乙醇脫氫酶活性，最終篩選得到具有抗高濃度乙醛環(huán)境且穩(wěn)定傳代的抗乙醛啤酒酵母菌株。該菌株編號(hào)為2，乙醛含量為4.42 mg/L±0.14 mg/L，較出發(fā)菌株降低了71.13 %；其乙醇脫氫酶（ADH1、ADH3與ADH4）活性顯著高于出發(fā)菌株（增幅為88.80 %），且遺傳穩(wěn)定性表現(xiàn)良好。

參考文獻(xiàn)：

[1] Joseph T H, William C H. Kinetics of acetaldehyde formation during the staling of lager beer[J]. Journal of the ASBC, 1977, 35(4)：183-186.

[2]李紅,吳永陽(yáng),張五九.啤酒中的乙醛[J].釀酒, 2004, 31(6)：

35-37.

[3] Wang D L, Sun J S, Zhang W J. Disruption of brewer's yeast alcohol dehydrogenase II gene and reduction of acetaldehyde content during brewery fermentation[J]. Journal of the ASBC, 2006, 64(4)：195-201.

[4]蔡勇,王肇悅,晏本菊.關(guān)于控制啤酒乙醛含量的研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造, 2008,182(5)：4-6.

[5]張媛媛,李崎.低產(chǎn)乙醛啤酒酵母的選育與研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué), 2011.

[6]沈楠,王金晶,劉春鳳,等.低產(chǎn)乙醛啤酒酵母的定向馴化篩選[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2013, 39(7)：94-97.

[7]全國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).GB/T 4928—2008啤酒分析方法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

The Screening of Acetaldehyde-resistant Beer Yeast Strains by High-concentration Acetaldehyde Method

JIN Weiyun, LI Hong and WANG Junwei
(China National Research Institute of Food & Fermentation Industries, Beijing 100015, China)

Abstract:Acetaldehyde is the main source of cardboard and rotten apple flavor in beer, which has a great influence on beer quality. In this study, acetaldehyde content in the fermenting liquid (low- temperature fermentation by starting strains and 20 experimental yeast strains screened by UV mutation and high-concentration acetaldehyde breeding method) was measured by GC. Then acetaldehyde content in fermenting liquid by experimental strains was compared with that by starting strains. And the activity of alcohol dehydrogenase and the stability test of the experimental strains (3 strains in total) with large decreasing amplitude of acetaldehyde content were carried out to select acetaldehyde-resistant yeast strains. The content of acetaldehyde of the final-selected beer yeast strains was 4.42±0.14 mg/L, 71.13 % lower than the starting strains; the activity of alcohol dehydrogenase (ADH1, ADH3 and ADH4 ) was significantly higher than the starting strains (increased by 88.80 % ), and good genetic stability was expressed.

Key words:microbe; acetaldehyde; acetaldehyde-resistant beer yeast; high-concentration acetaldehyde method; alcohol dehydrogenase

通訊作者：李紅（1978-），男，博士，博士后，高級(jí)工程師，研究方向：食品發(fā)酵。

作者簡(jiǎn)介：金瑋鋆。

收稿日期：2015-07-23

基金項(xiàng)目：國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目（2014DFG31770）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015319

中圖分類號(hào)：TS262.5；TS261.1；TS261.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）01-0010-05