魚粉中肌胃糜爛素的研究進(jìn)展

趙 艷，張鳳枰，劉耀敏，楊發(fā)樹，張艷紅，范秀麗

(通威股份有限公司，水產(chǎn)畜禽營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041)

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魚粉中肌胃糜爛素的研究進(jìn)展

趙 艷，張鳳枰，劉耀敏，楊發(fā)樹，張艷紅，范秀麗

(通威股份有限公司，水產(chǎn)畜禽營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041)

摘要肌胃糜爛素(Gizzerosine，GZ) 是褐色魚粉制造加工過程中產(chǎn)生的一種生物胺。該毒素會(huì)引起家禽的“黑色嘔吐癥”。對(duì)肌胃糜爛素的生理功能、生成量的影響因素和檢測方法進(jìn)行了綜述，并對(duì)其今后的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞肌胃糜爛素；魚粉；生理功能；檢測方法；生成量

魚粉是水產(chǎn)飼料中傳統(tǒng)的主要蛋白源，不僅蛋白質(zhì)含量高、必需氨基酸齊全，而且富含必需脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素和可消化能等魚類生長繁育必需的營養(yǎng)成分，且適口性好，世界上許多地區(qū)的精養(yǎng)漁業(yè)都將魚粉作為主要的蛋白源。

肌胃糜爛素是魚粉在加熱干燥處理時(shí)由魚粉中的游離組氨酸及其代謝產(chǎn)物組胺與魚粉中的蛋白質(zhì)(賴氨酸的ε-氨基)發(fā)生反應(yīng)而形成的，而且主要與魚粉加工時(shí)的溫度有關(guān)，當(dāng)加工溫度超過120 ℃時(shí)肌胃糜爛素含量上升，溫度愈高，毒素愈易產(chǎn)生。肌胃糜爛素的促胃酸分泌作用是組胺的10倍，引起肌胃糜爛的能力是組胺的300倍。魚粉如果發(fā)生腐敗、發(fā)霉、變質(zhì)等現(xiàn)象，會(huì)協(xié)同引起肌胃潰瘍糜爛，用沙丁魚制得的魚粉(紅魚粉)最易生成這種化合物。筆者對(duì)肌胃糜爛素的生理功能、生成量的影響因素和檢測方法進(jìn)行了綜述，并對(duì)其今后的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

1肌胃糜爛素的生理功能

1.1肌胃糜爛素的毒性肌胃糜爛素的作用與組胺類似，會(huì)與胃壁細(xì)胞上的組胺H2受體結(jié)合，刺激大量胃酸的分泌，其刺激分泌胃酸的能力是組胺的10倍[1]。過量的胃酸會(huì)傷害禽類動(dòng)物的肌胃黏膜，引起肌胃內(nèi)角質(zhì)膜發(fā)生糜爛和潰瘍。肌胃糜爛素在促進(jìn)cAMP形成方面強(qiáng)于組胺1 000倍[2-3]。Mori等[4]指出僅L型的肌胃糜爛素會(huì)引起肌胃糜爛素。Sugahara等[5]在日糧中添加20個(gè)水平的肌胃糜爛素(0.1～18.0 mg/kg)和7個(gè)水平的肌胃糜爛素分別飼喂4日齡雛雞7和28 d，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)日糧中肌胃糜爛素的水平高于0.45 mg/kg時(shí)肌胃糜爛評(píng)分開始升高；為期28 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肌胃糜爛素的水平在 0.90 mg/kg以上對(duì)體重增加沒有負(fù)面的影響；為期7 d和28 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肌胃糜爛素的最小致死量分別為2.0和0.8 mg/kg；當(dāng)日糧中肌胃糜爛素的濃度為18.0 mg/kg時(shí)，死亡率達(dá)到最高，為70%。肌胃糜爛素除了對(duì)家禽產(chǎn)生毒副作用，肌胃糜爛素作為魚飼料的一種污染物，還可能對(duì)虹鱒產(chǎn)生不良影響，造成虹鱒的胃膨大[6]。

1.2肌胃糜爛素的其他生理功能Sugahara等[7]研究表明飼料中添加低濃度(0.4和0.5 mg/kg)的肌胃糜爛素，不僅不會(huì)致病，反而能提高雛雞的攝食量和體重。Horikawa等[8]研究表明當(dāng)VD3添加量為50 μg/kg時(shí)，日糧中添加2 mg/kg的肌胃糜爛素能顯著提高雛雞大腿中灰分和Ca含量。

2肌胃糜爛素生成量的影響因素

2.1魚粉加工條件1978年，在日本發(fā)現(xiàn)雞的“黑色嘔吐癥”的發(fā)病原因是由于使用南美生產(chǎn)的魚粉，魚粉中的肌胃糜爛素會(huì)導(dǎo)致雞的“黑色嘔吐癥”。由于含肌胃糜爛素魚粉的含水量都較低(2.7%)，因此懷疑其是魚粉的加工過程中產(chǎn)生的。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，加熱溫度和時(shí)間是影響肌胃糜爛素生成的2個(gè)主要因素。此外，加工過程中的壓力也是其影響因素之一。為提升魚粉的加工效率，可將蒸氣增加到800～1 000 kPa，溫度約為180 ℃，這成為肌胃糜爛素產(chǎn)生的最佳條件。若將壓力降到300～400 kPa，當(dāng)溫度為140 ℃時(shí)，則不會(huì)生成肌胃糜爛素。

當(dāng)加工溫度達(dá)到100 ℃，2 h后肌胃糜爛素就會(huì)開始生成；150 ℃加熱3 h后，肌胃糜爛素則開始分解；當(dāng)加熱溫度達(dá)到190 ℃，肌胃糜爛素達(dá)到最大生成量(25.0 mg/kg)；當(dāng)溫度為200 ℃時(shí)，肌胃糜爛素的含量降至23.6 mg/kg。研究表明，魚粉在80 ℃條件下持續(xù)加熱l～5 d，肌胃糜爛素也會(huì)緩慢生成。因此，在生產(chǎn)加工魚粉過程中要考慮壓力、溫度、加熱時(shí)間等影響因素[9]。

2.2賴氨酸的添加量采用一般市售魚粉和添加5%賴氨酸的魚粉作為試驗(yàn)料，經(jīng)過130 ℃高溫加熱3 h后，用配合飼料(含60%試驗(yàn)料)飼喂雛雞7 d。同時(shí)，高賴氨酸魚粉(其中不添加游離賴氨酸)在上述同樣條件下經(jīng)過高溫加熱后，用配合飼料(含30%試驗(yàn)料)飼喂雛雞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不含肌胃糜爛素的市售魚粉在經(jīng)過130 ℃高溫加熱3 h后，試驗(yàn)組雛雞出現(xiàn)采食量減少、生長性能下降的情況，甚至有雛雞死亡。添加5%賴氨酸魚粉在經(jīng)過130 ℃高溫加熱3 h后，試驗(yàn)組雛雞在采食量、生長性能和肌胃糜爛癥狀等方面比不添加賴氨酸的對(duì)照組更好。同時(shí)，經(jīng)過高溫加熱后添加5%賴氨酸的魚粉的肌胃糜爛素生成量減少了一半[10]。

3肌胃糜爛素的檢測方法

3.1放射免疫檢測法Marcela等[11]用水溶性Bolton-Hunter蛋白碘化試劑和非水溶性碘化試劑，用125I標(biāo)記肌胃糜爛素。125I-GZ半抗原與肌胃糜爛素的多克隆抗體結(jié)合后，再用組胺-瓊脂糖凝膠柱吸收仍有免疫活性。肌胃糜爛素在0.000 1～0.100 0 μg/mL的濃度范圍呈線性。Rosselot等[12]建立了同源性放射免疫分析法檢測魚粉中肌胃糜爛素活性的方法，從雌兔身上得到3種多克隆抗體(GR316、GR415和 GR418)，這3種抗體的放射免疫分析方法的檢出限分別為0.048、0.780和0.390 ng/mg。研究了這些抗體與賴氨酸、組氨酸和組胺的交叉反應(yīng)，最終選擇GR415作為檢測魚粉中肌胃糜爛素的抗體。

3.2酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法，又稱為ELISA法，其原理是使抗原或抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，根據(jù)反應(yīng)顏色的深淺來進(jìn)行定性或定量分析。Manosalva等[13]制備了抗GZ 3H4單克隆抗體，BALB-c白鼠用結(jié)合血藍(lán)蛋白的抗-GZ 3H4抗體免疫，得到了34種可能的抗獨(dú)特型抗體，通過它們與雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清液和特異基因型乳膠粒子的被動(dòng)膠合程度來區(qū)分這些抗體。采用競爭性放射免疫檢測方法來分析抗獨(dú)特型抗體，以確定這些抗體分離125I-GZ與抗-GZ 3H4-獨(dú)特型抗體之間互相作用的能力。確定了2D11、2H6、3A12這3種抗-獨(dú)特型抗體，再通過競爭性酶聯(lián)免疫方法分析，結(jié)果表明肌胃糜爛素在0.1～10.0 μg/mL范圍內(nèi)靈敏度好，3A12抗獨(dú)特型抗體表現(xiàn)出最好的性能。

3.3紙電泳法Tao等[14]建立了魚粉中肌胃糜爛素含量的紙電泳分析法，魚粉樣品用0.1 mol/L的鹽酸提取，經(jīng)離心后取上清液，進(jìn)行紙電泳試驗(yàn)。電泳時(shí)間18 min，肌胃糜爛素用Pauly試劑顯色，根據(jù)色斑的強(qiáng)度使用圖像處理軟件進(jìn)行計(jì)算，肌胃糜爛素的線性范圍為30～1 000 ng，檢測濃度低至10 mg/kg。

3.4高效液相色譜法Ito等[15]開發(fā)了鄰苯二甲醛衍生后，采用液相色譜法檢測肌胃糜爛素的方法。魚粉樣品在110 ℃下用6 mol/L的鹽酸水解24 h，在水解液中添加少量活性炭。過濾后，濾液通過減壓蒸干鹽酸，經(jīng)IR-CG50和RP-8固相萃取柱凈化，對(duì)洗出液凍干后再復(fù)溶，通過ODS柱，流速1.5 mL/min，用三乙胺醋酸緩沖溶液洗脫得到含有肌胃糜爛素溶液。洗出液再經(jīng)過凍干處理，水溶解后用OPA衍生，肌胃糜爛素在0.2～5.0 μg的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回收率為95%～102%。Ohta等[16]簡化了凈化步驟，用Amberlite IR CG-50柱色譜法一步凈化法，采用日立2619-F分析柱和梯度洗脫，結(jié)合高效液相色譜-OPA柱后衍生方法成功檢測了魚粉樣品中的肌胃糜爛素。熒光激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長為450 nm。結(jié)果表明，魚粉中肌胃糜爛素的回收率在90%以上，檢出限為1 mg/kg。Murakita等[17]發(fā)現(xiàn)OPA衍生反應(yīng)在不添加硫醇試劑時(shí)，能排除魚粉樣品檢測的雜質(zhì)干擾，檢出限為0.5 mg/kg，加標(biāo)回收率達(dá)到98.2%。

3.5高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法Uhlig等[18]建立了親水性作用色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法檢測肌胃糜爛素的方法。樣品經(jīng)過酸水解和脫鹽，并利用聚合物固相萃取吸附劑進(jìn)行陽離子交換來凈化，采用梯度洗脫，進(jìn)行上機(jī)測定。該方法的線性范圍為70～940 ng/mL，平均回收率為68%～82%，檢出限為0.25 mg/kg。

4展望

目前，國內(nèi)外對(duì)肌胃糜爛素的大多數(shù)研究都是針對(duì)肌胃糜爛素對(duì)禽類產(chǎn)生的生理性影響和一些治療措施等方面的報(bào)道，由于缺乏商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)品，合成方法困難，對(duì)其他動(dòng)物(如有胃魚類)的影響則少見報(bào)道，對(duì)魚類的毒理學(xué)研究仍有很多值得關(guān)注的問題。此外，不同的檢測方法各有其利弊。例如，高效液相色譜法及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是定量檢測和分析肌胃糜爛素最經(jīng)典最可靠的技術(shù)，靈敏度、準(zhǔn)確度和選擇性較高；酶聯(lián)免疫吸附等方法也有其特有的優(yōu)勢(shì)，仍處于研究與開發(fā)階段，其大規(guī)模應(yīng)用在檢測精度、穩(wěn)定性、易操作性和經(jīng)濟(jì)性等方面尚有待加強(qiáng)和提高。

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Research Status of Gizzerosine in Fish Meal

ZHAO Yan，ZHANG Feng-ping，LIU Yao-min et al

(Key Laboratory of Aquatic，Livestock，Poultry Nutrition and Healthy Culturing，Ministry of Agriculture，Tongwei Co.，Ltd.，Chengdu，Sichuan 610041)

Key wordsGizzerosine; Fish meal; Physiological function; Detection method; Formation quantity

AbstractGizzerosine is a biogenic amine formed during the treatment of brown fish mea1.The toxin can cause a serious disease in poultry ‘Black Vomit’.In this research，the physiological function，influence factors of formation quantity，and the detection methods of gizzerosine were reviewed.The development direction of gizzerosine was forecasted.

基金項(xiàng)目四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目( 2011NZ0071)。

作者簡介趙艷(1983- )，女，河南滎陽人，高級(jí)工程師，碩士，從事飼料營養(yǎng)及質(zhì)量安全評(píng)價(jià)研究。

收稿日期2016-02-02

中圖分類號(hào)S 963

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)07-086-02