胡椒梗中揮發(fā)性成分提取及其抑菌效果研究

王延輝，師邱毅，孫金才，楊宸笑

(1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波 315100；2.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校功能食品研究所，浙江寧波 315100)

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胡椒梗中揮發(fā)性成分提取及其抑菌效果研究

王延輝1，2，師邱毅1，2，孫金才1，楊宸笑1

(1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波 315100；2.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校功能食品研究所，浙江寧波 315100)

摘要[目的]提取并分析胡椒果梗和胡椒果中的揮發(fā)性化合物成分及其抑菌效果。[方法] 聯(lián)合采用頂空固相微萃取(HS-SPME)和同時蒸餾萃取(SDE)提取胡椒果梗和胡椒果中的揮發(fā)性化合物，利用氣質(zhì)聯(lián)用對提取的揮發(fā)性成分進行定性和相對定量分析；采用濾紙片抑菌圈法測定胡椒梗揮發(fā)油抑菌效果。[結(jié)果] 試驗顯示，胡椒梗共分離鑒定出α-香芹烯27.23%、β-月桂烯8.48%、α-蒎烯8.32%、莰烯7.77%、α-檸檬醛7.68%、松油醇7.52%、α-石竹烯4.99%等85種化合物，胡椒梗與胡椒中的揮發(fā)性成分無明顯差異；其提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制能力無明顯差異。[結(jié)論] 研究可為胡椒果梗的綜合利用提供理論數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用；胡椒梗；揮發(fā)油；抑菌

胡椒(PipernigrumL.)屬胡椒目胡椒科，為胡椒科植物胡椒的果實，又名浮椒、玉椒，主要用于西式食品的調(diào)味，其加工品胡椒油于2003年列入食品添加劑國家標準。胡椒溫中，下氣，消痰，解毒，可治寒痰食積，脘腹冷痛，反胃，嘔吐等，同時具有“熱帶香料之王”的稱號。近年來的研究表明，胡椒在鎮(zhèn)痛、抗炎、抗驚厥、殺蟲、抗癌、抗氧化、抑菌等多方面具有活性[1-6]。

國內(nèi)針對胡椒的研究主要集中在胡椒的種植、胡椒及胡椒粉的加工、胡椒油的生產(chǎn)以及胡椒初加工機械的研制與開發(fā)等方面[7-13]。其中胡椒油的生產(chǎn)已具有相當(dāng)大的規(guī)模，但在胡椒油生產(chǎn)過程中存在的大量胡椒梗則主要做為廢料處理，對環(huán)境造成一定的污染和資源浪費。因此筆者聯(lián)合采用頂空固相微萃取(HS-SPME)和同時蒸餾萃取提取(SDE)分析胡椒梗和胡椒中的揮發(fā)性化合物成分，利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分離并鑒定其主要成分，并對揮發(fā)油的抑菌效果進行了初步研究，以期為胡椒果梗的綜合利用提供理論數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料新鮮青胡椒果采集于海南某胡椒種植基地，冰溫運輸至實驗室，聚乙烯袋分裝密封后置于4 ℃環(huán)境保存，果梗分離后分別液氮粉碎預(yù)冷，冷凍干燥后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

金黃色葡萄球菌(Staphlococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)，廣東省微生物菌種保藏中心；石油醚，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；正己烷，色譜純，賽默飛(美國)；SDE同時蒸餾裝置，自制；LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，海道夫(德國)；QGC-121氮吹儀，泉島。

1.2方法

1.2.1揮發(fā)油及固相微萃取提取。頂空揮發(fā)性成分提取條件：準確稱取1.0 g凍干粉于頂空樣品瓶中，立即封口，金屬浴60 ℃平衡40 min，將65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取頭(Supelco，USA)插入頂空樣品瓶吸附30 min，進樣口5 min解析，然后進行氣相分析。氣相條件：進樣口溫度250 ℃，不分流進樣；Trace1300-ISQ(Thermo fisher，USA)，30 m×0.25 mm×0.25 μm TR-5MS色譜柱；初溫40 ℃，保留3 min，5 ℃/min上升到100 ℃，保留5 min，4 ℃/min上升到250 ℃，保留10 min。質(zhì)譜條件：傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，EI源電壓70 eV。

同時蒸餾萃取提取條件：稱取50 g(精確到0.1 g)樣品，放入500 mL的圓底燒瓶中，加入200 mL超純水，加入少量玻璃珠。接收端接預(yù)裝90 mL沸程90～120 ℃石油醚的250 mL圓底燒瓶內(nèi)，85 ℃恒溫水浴提取60 min。萃取結(jié)束上層有機相過50 g無水硫酸鈉柱脫除水分。濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干，加1 mL色譜純正己烷轉(zhuǎn)移至樣品瓶。氣相條件：進樣口溫度250 ℃，分流進樣，分流比1∶50；Trace1300-ISQ(Thermo Fisher，USA)，30 m×0.25 mm×0.25 μm TR-5MS色譜柱；初溫60 ℃，保留3 min，5 ℃/min上升到100 ℃，保留5 min，4 ℃/min上升到250 ℃，保留10 min。質(zhì)譜條件：傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，EI源電壓70 eV。1.2.2萃取前處理。樣品萃取前，萃取頭須按照說明書在進樣口老化。以揮發(fā)性化合物總色譜峰面積和種類為指標，比較分析了萃取頭類型、樣品平衡時間、萃取時間、解析時間等對揮發(fā)性化合物的提取效果。

1.2.3揮發(fā)油抑菌效果測定。將直徑為6 mm的圓形定性濾紙片經(jīng)160 ℃ 2 h干熱滅菌后，置于不同濃度的胡椒和胡椒梗揮發(fā)油中浸漬4 h，之后濾紙片無菌干燥備用。將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活化并調(diào)整好菌液濃度，取菌懸液0.1 mL加到PCA(平板計數(shù)瓊脂)培養(yǎng)基上并涂布均勻。取浸有揮發(fā)油的濾紙片貼在含菌培養(yǎng)基平板上，每塊平板平行做3片，每種菌平行做3塊平板。同時做提取溶劑(石油醚)陰性對照，青霉素G為陽性對照。置培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。采用迅數(shù)CzoneG6T菌落計數(shù)儀測定抑菌圈直徑，結(jié)果取3次重復(fù)試驗的平均值。

1.3數(shù)據(jù)處理揮發(fā)性化合物鑒定采用Thermo Fisher Main lib和NIST11 譜庫檢索，保留指數(shù)定性，結(jié)合已有參考文獻進行人工解析確認，面積歸一化法進行揮發(fā)性化合物的定量分析。

2結(jié)果與分析

2.1SPME萃取條件的選擇及萃取結(jié)果分析比較了50/30 μm PDMS/CAR/DVB、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 3種固相微萃取萃取頭在60 ℃金屬浴恒溫平衡1 h的

萃取效果，揮發(fā)性化合物的峰面積和揮發(fā)性化合物的種類如圖1所示?？梢钥闯?，50/30 μm PDMS/CAR/DVB分離出140個色譜峰，總離子峰面積5.64×109，其提取的揮發(fā)性化合物種類和含量都優(yōu)于65 μm PDMS/DVB和75 μm CAR/PDMS萃取頭，因此采用50/30 μm PDMS/CAR/DVB萃取頭進行試驗。

同時也對比研究了平衡溫度和平衡時間對萃取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著萃取溫度的增加，揮發(fā)性化合物的總離子流峰面積逐漸增加，同時水蒸氣易吸附于萃取頭上，影響萃取效果，因此設(shè)定萃取溫度60 ℃。60 ℃萃取20～80 min，發(fā)現(xiàn)40 min后達到峰值，纖維萃取頭涂層較薄，容易飽和，之后所萃取的含量有所下降，因此設(shè)定萃取時間40 min。

采用50/30 μm PDMS/CAR/DVB 萃取頭提取并GC-MS進樣口熱解析后，經(jīng)NIST譜圖檢索并與相關(guān)文獻比對，面積歸一化法測定揮發(fā)性組分的相對百分含量，胡椒梗中檢出并確定出59種揮發(fā)性化合物，胡椒中檢出55種揮發(fā)性化合物，具體見圖3和表1。胡椒梗中萜類48種，含量97.35%；酚類1種，含量0.01%；醛類5種，含量0.12%；烯醇類3種，含量0.07；酯類1種，含量0.09%；其他類，1種。胡椒中萜類48種，含量98.77%；酚類1種，含量0.01%；醛類3種，含量0.07%；烯醇類2種，含量0.13%；酯類1種，含量0.05%。

胡椒梗和胡椒揮發(fā)性化合物中萜類的主要成分為d-香芹烯(d-Limonene)、β-松油烯(β-Terpinene)、桉葉油醇(Cineole)、d-α-蒎烯(d-α-Pinene)、β-蒎烯(β-Pinene)、α-檸檬醛(α-Citral)、β-月桂烯(β-Myrcene)、β-檸檬醛(β-Citral)、(+)-香茅醛(6-Octenal，3，7-dimethyl-，(R)-)、β-石竹烯(β-Caryophyllen)、莰烯(Camphene)、松油醇(Terpineol)、水芹烯(Phellandrene)、羅勒烯(Ocimene)、β-欖香烯(β-Elemen)、芫荽醇(Linalol)、3-側(cè)柏烯(3-Thujene)、d-大根香葉烯(D-Germacrene)。

2.2水蒸氣同時蒸餾提取條件下胡椒梗與胡椒揮發(fā)性化合物對比水蒸氣同時蒸餾萃取胡椒梗和胡椒中的揮發(fā)油，總離子流色譜圖見圖4，揮發(fā)性化合物鑒定結(jié)果見表2。經(jīng)GC-MS分離鑒定，胡椒梗中檢出并確定54種揮發(fā)性化合物，胡椒中檢出50種揮發(fā)性化合物。胡椒梗中萜類50種，含量86.01%；醇類2種，含量0.02%。胡椒中萜類48種，含量75.45%；醇類2種，含量0.11%。

在胡椒萜類中主要發(fā)揮發(fā)性化合物為α-松油醇(α-Terpineol)、反式-松香芹醇(trans-Carveol)、α-環(huán)氧蒎烷(α-Pinene oxide)、欖香烯(Elemene)、異戊酸香葉酯(Geranyl isovalerate)、喇叭茶醇(Ledol)、檸檬醛(Citral)、β-檸檬醛(β-Citral)、桉樹醇(Eucalyptol)、L-松油醇(L-Terpineol)、(+)-香茅醛((R)-(+)-Citronellal)、D-檸檬烯(D-Limonene)、石竹烯(Caryophyllene)、芫荽醇(Linalool)、松油烯-4-醇(Terpinen-4-ol)、β-欖香烯(β-Elemene)、β-松油烯(β-Terpinene)、石竹烯氧化物(Caryophyllene oxide)、左旋-β-蒎烯((1S)-(1)-β-Pinene)、香茅醇(Citronellol)、β-蒎烯(β-Pinene)、香葉醇(Geraniol)、順馬鞭草烯醇(cis-Verbenol)、松油醇(Terpineol)、cis-香葉醇(cis-Geraniol)。

2.3抑菌效果采用濾紙片法測量了胡椒及胡椒梗揮發(fā)油的抑菌作用，由表3可見，胡椒與胡椒梗揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑相差不大，在抑制這2種菌

種方面沒有明顯區(qū)別。

表3胡椒及胡椒梗揮發(fā)油抑菌效果

Table 3Antibacterial effects of volatile oils inP.nigrumandP.nigrumstalks

3討論

通過使用SPME和SDE提取方法，胡椒梗和胡椒中共確認出85種揮發(fā)性成分，其中30種屬于共同檢出成分，均屬于萜類物質(zhì)，含量較高的是d-香芹烯(D-Limonene)、β-松油烯(β-Terpinene)、桉樹醇(Cineole)、D-α-蒎烯(D-α-Pinene)、β-蒎烯(β-Pinene)、β-檸檬醛(β-Citral)、(+)-香茅醛(((R)-(+)-Citronellal))、β-石竹烯(β-Caryophyllen)、莰烯(Camphene)、松油醇(Terpineol)、水芹烯(Phellandrene)、羅勒烯(Ocimene)、β-欖香烯(β-Elemen)，這些成分在白胡椒粉、山胡椒葉、黑胡椒等都有分離鑒定出，為關(guān)鍵的揮發(fā)油成分[14-19]。因此，可以有效利用胡椒梗提取揮發(fā)油用來生產(chǎn)胡椒油食品添加劑，同時胡椒梗揮發(fā)油具有胡椒類似的抑菌抗氧化效果，也可以作為防腐劑使用。

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Extraction of Volatile Components fromPipernigrumL. Stalk and Their Antibacterial Effects

WANG Yan-hui1,2, SHI Qiu-yi1,2, SUN Jin-cai1et al

(1. Zhejiang Pharmaceutical College, Ningbo, Zhejiang 315100; 2. Functional Food Research Institute of Zhejiang Pharmaceutical College, Ningbo, Zhejiang 315100)

Key wordsGas Chromatograph Mass Spectrometer (GCMS);P.nigrumstalks; Volatile oil; Bacteriostasis

Abstract[Objective] To extract and analyze the volatile compounds and antibacterial effects ofPipernigrumL. stalks and fruits. [Method] Volatile compounds were extracted fromP.nigrumstalks and fruits by HS-SPME and SDE. Qualitative and relative quantitative analysis of volatile components was carried out by GC-MS. Antibacterial effects of essential oil inP.nigrumstalks were detected by filter paper inhibition zone method. [Result] d-limonene(27.23%), β-myrcene (8.48%), α-pinene (8.32%), camphene(7.77%), α-citral(7.68%), terpineol(7.52%) and caryophyllene (4.99%) were the major components of the 89 identified volatile compounds in theP.nigrumstalk. Volatile components ofP.nigrumandP.nigrumstalks had no significant differences. Inhibiting ability of extracts had no significant differences between Staphylococcus aureus and Escherichia coli. [Conclusion] This research provides theoretical data and technical support for the comprehensive utilization ofP.nigrumstalks.

基金項目浙江省教育廳高?？蒲许椖?Y201320218)；浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?？蒲许椖?ZPCSR2013008)；慈溪市科技計劃項目(CN2014019)；寧波科技富民項目(201501CX-D01021)。

作者簡介王延輝(1982-)，男，河南許昌人，講師，碩士，從事食品科學(xué)研究。

收稿日期2016-01-26

中圖分類號S 573+.9

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)07-052-05