花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)的抑制作用

李 晴，許騰騰，張佳慧，趙慧娟，劉尊英

(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)是一種細(xì)菌之間溝通交流及傳遞信息的方式，此機(jī)制普遍存在于革蘭氏陰性菌與陽性菌中,當(dāng)外界環(huán)境中細(xì)菌分泌的信號(hào)分子積累到一定閾值時(shí)，便會(huì)與細(xì)菌體內(nèi)特異性受體相結(jié)合，被細(xì)菌感知，從而啟動(dòng)細(xì)菌相關(guān)基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)菌的相關(guān)性狀[1]。相關(guān)研究表明，致病菌毒力因子的表達(dá)及腐敗菌的相關(guān)腐敗特性，如生物被膜的形成、胞外蛋白酶、嗜鐵素的產(chǎn)生等均依賴于QS系統(tǒng)的調(diào)控[2-3]。近年來，相關(guān)研究表明很多食品腐敗均與其腐敗菌QS密切相關(guān)，如Zhu等[4]研究表明特定腐敗菌波羅地海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)可通過竊聽周圍環(huán)境中的N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)調(diào)控腐敗特性的表達(dá)，加快冷藏凡納濱對(duì)蝦的腐敗，Christensen等[5]發(fā)現(xiàn)SerratiaproteamaculansB5a的sprl基因(參與AHLs合成)缺陷株不能導(dǎo)致牛奶腐敗，而外源添加AHLs時(shí)又恢復(fù)了其致腐能力。群體感應(yīng)抑制劑(QSIs)指不影響細(xì)菌正常生長(zhǎng)卻能干擾或抑制細(xì)菌間信息交流的物質(zhì)[6]。QSI可在減少細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的前提下有效降低細(xì)菌的致腐性與致病性。目前，天然來源的QSI安全且毒性小，成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。Cosa等[7]研究發(fā)現(xiàn)，來源于果蔬及香辛料的多酚類、黃酮類及萜類等小分子活性化合物均有群體感應(yīng)抑制作用，芹菜所含的一種3-正丁基-4,5-二氫鄰苯二甲酸酯活性化合物能顯著抑制紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum) CV026紫色色素產(chǎn)量，具有QS抑制作用。薄荷油中的薄荷醇降低了依賴于AHLs的嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)及銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)毒力因子和生物膜的形成，具有廣譜QS抑制活性[8]。

花椒，屬蕓香科落葉小喬木，是一種傳統(tǒng)的中藥與調(diào)味香料，其綠色安全、價(jià)格較低，被廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域[9]。花椒主要化學(xué)成分為揮發(fā)油、酰胺、生物堿等[10]。花椒具有良好的抗菌、抗氧化作用，可用于肉制品的保鮮，但其QS抑制活性卻鮮有報(bào)道[11]。研究花椒提取物的群體感應(yīng)抑制活性，可為進(jìn)一步開發(fā)利用花椒提供依據(jù)。嗜水氣單胞菌屬氣單胞菌屬，是一種革蘭氏陰性菌，在自然界尤其水中廣泛分布，能夠產(chǎn)生外毒素，是常見的致病菌和腐敗菌之一[12]。隨著水產(chǎn)品保鮮領(lǐng)域研究報(bào)道的增多，嗜水氣單胞菌致腐性逐漸受到關(guān)注。于紅雷等[13]從冷藏凡納濱對(duì)蝦中分離并鑒定出1株嗜水氣單胞菌，并發(fā)現(xiàn)其具有分泌C4-HSL的能力。此外，外源添加信號(hào)分子可通過增強(qiáng)QS從而提高其蛋白酶活性。李學(xué)鵬等[14]研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌嗜鐵素的產(chǎn)生及蛋白水解活性等腐敗特性的強(qiáng)弱均與QS有關(guān)，且加入丹皮提取物可有效減少AHLs產(chǎn)生從而減弱其致腐能力。

本文中，筆者以花椒提取物為研究對(duì)象，制備并探討其QS抑制活性及其對(duì)嗜水氣單胞菌生物被膜、蛋白酶活性、細(xì)菌泳動(dòng)、信號(hào)分子產(chǎn)生的抑制效果，為基于群體感應(yīng)抑制原理的天然保鮮劑開發(fā)提供理論依據(jù)與參考，同時(shí)進(jìn)一步豐富和創(chuàng)新水產(chǎn)品貯藏保鮮理論。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花椒，購于青島當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；報(bào)告菌株紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum) CV026，美國(guó)德克薩斯州立大學(xué)McLean J C教授惠贈(zèng)；目標(biāo)菌株嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)從冷藏凡納濱對(duì)蝦中分離得到，保存于實(shí)驗(yàn)室。

N-己?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品(C6-HSL)、二甲基亞砜(DMSO)，Sigma公司；偶氮酪蛋白、卡那霉素、十二烷基硫酸鈉、瓊脂，Solarbio公司；LB肉湯、LB瓊脂，青島海博生物技術(shù)有限公司；其余試劑均購自國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花椒提取物的制備

原料花椒于40 ℃干燥箱烘干24 h，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎處理后過0.180 mm篩。取30 g粉末于500 mL燒杯中，按料液比為1∶ 12(g/mL)的比例加入無水乙醇，混合攪拌均勻。后利用超聲波進(jìn)行輔助提取，工作條件為功率180 W、溫度50 ℃提取時(shí)間3 h。依次進(jìn)行過濾、減壓抽濾后得到提取液，用旋蒸法在45 ℃溫度下進(jìn)行濃縮。將得到的油狀濃縮物置于4 ℃避光、密封保存。

1.2.2 抑菌活性及群體感應(yīng)抑制活性檢測(cè)

最小抑菌濃度檢測(cè):嗜水氣單胞菌與紫色桿菌CV026過夜活化2次后，按體積分?jǐn)?shù)2%接種量分別接種于新鮮 LB 液體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)紫色桿菌CV026的LB肉湯中需含有20 μg/mL卡那霉素)。后在48孔透明酶標(biāo)板中加入不同質(zhì)量濃度的花椒提取物(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mg/mL)，30 ℃培養(yǎng)24 h 后測(cè)定OD600。以添加體積分?jǐn)?shù)2% DMSO的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照。因花椒提取濃縮物難溶于水，配制溶液前，先將其溶解于少量DMSO中，過0.22 μm無菌濾膜，試驗(yàn)時(shí)用無菌水或LB培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。為防止影響細(xì)菌正常生長(zhǎng)，保證DMSO不超過2%。

群體感應(yīng)抑制活性檢測(cè):經(jīng)過活化的報(bào)告菌株紫色桿菌CV026按1%接入量接種于含有20 μg/mL卡那霉素的新鮮LB肉湯中，搖床培養(yǎng)約16 h。后吸取1 mL菌液與100 mL冷卻至40 ℃左右的含有20 μg/mL C6-HSL LB半固體培養(yǎng)基混勻，倒平板。待凝固后用牛津杯打孔，分別加入100 μL亞抑菌濃度為1.0、2.0和4.0 mg/mL的花椒提取物，在28 ℃條件下培養(yǎng)1～2 d，觀察紫色菌素的產(chǎn)生情況。以添加2% DMSO的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照。

1.2.3 紫色色素產(chǎn)量定量檢測(cè)

報(bào)告菌株紫色桿菌CV026過夜活化后，以1%接種量接種于含亞抑菌濃度的花椒提取物(1.0、4.0、8.0和16.0 mg/mL)加入200 μL的LB肉湯中(含有20 μg/mL C6-HSL)，160 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。將未添加花椒提取物的設(shè)為對(duì)照組。同時(shí)，不添加信號(hào)分子，將紫色桿菌CV026以相同接種量接種于不同濃度的LB肉湯中，相同條件下培養(yǎng)，測(cè)定紫色桿菌CV026生長(zhǎng)情況。依次取200 μL添加信號(hào)分子實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)液于1.5 mL離心管中，加入200 μL10%十二烷基硫酸鈉，渦旋振蕩5 s，室溫下靜置5 min，后加入900 μL飽和正丁醇(50 mL正丁醇與10 mL蒸餾水)，渦旋5 s,10 000 r/min離心5 min。收集含有紫色色素的上清液，測(cè)定OD595。以對(duì)照組紫色色素產(chǎn)量為100%，表示紫色色素相對(duì)產(chǎn)量。

1.2.4 花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的影響

過夜活化的嗜水氣單胞菌以1%體積分?jǐn)?shù)接種于96孔板200 μL新鮮LB肉湯中，分別加入不同劑量的花椒提取物，使其最終質(zhì)量濃度為1.0、4.0、8.0和16.0 mg/mL，以加入相同劑量2% DMSO的培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h。測(cè)定OD600后，去除培養(yǎng)液和浮游細(xì)菌，用無菌水輕輕沖洗3遍。然后自然干燥40 min，在室溫下用250 μL 1 g/L結(jié)晶紫染色15 min，用無菌水洗滌3次去除多余染料，在空氣中自然晾干40 min。后加250 μL 95%乙醇脫色5～10 min，吸取200 μL轉(zhuǎn)移到新的酶標(biāo)板中檢測(cè)OD590。生物膜相對(duì)抑制率=(對(duì)照OD590-樣品OD590)/對(duì)照OD590×100%。對(duì)照OD590和樣品OD590分別為陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組測(cè)定的OD590。

1.2.5 花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌蛋白酶活性的影響

以偶氮酪蛋白為底物，取含有不同質(zhì)量濃度(0、1.0、4.0、8.0和16.0 mg/mL)花椒提取物培養(yǎng)24 h的嗜水氣單胞菌菌液，4 ℃、12 000 r/min離心5 min后得無菌上清。取400 μL細(xì)菌上清液，加入200 μL 20 mg/mL偶氮酪蛋白，混合均勻后，置于30 ℃水浴1 h后加入600 μL三氯乙酸(100 g/L)沉淀蛋白。對(duì)照組為加入偶氮酪蛋白水浴1h后，先加三氯乙酸沉淀，再加細(xì)菌上清，后離心處理。取500 μL上清液與等體積的NaOH(1 mol/L)混合，測(cè)定OD440吸光值。以對(duì)照組為100%，表示蛋白酶活力的相對(duì)強(qiáng)弱。

1.2.6 花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌泳動(dòng)的影響

細(xì)菌泳動(dòng)性測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行，向冷卻至40 ℃的泳動(dòng)瓊脂培養(yǎng)基(10 g/L胰蛋白胨、5 g/L NaCl、3 g/L瓊脂)中加入經(jīng)0.22 μm濾膜過濾的花椒提取物，使其終質(zhì)量濃度為1.0、4.0、8.0和16.0 mg/mL。以不加花椒提取物的菌液為陰性對(duì)照。充分混勻后倒平板，冷卻后向平板中央滴加1 μL過夜活化的嗜水氣單胞菌菌液，無菌風(fēng)吹干，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察與測(cè)量移動(dòng)直徑。

1.2.7 花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌產(chǎn)信號(hào)分子的影響

AHLs信號(hào)分子提?。哼^夜活化的嗜水氣單胞菌以1%體積分?jǐn)?shù)接種于200 mL LB肉湯中，分別添加不同劑量花椒提取物，使其終質(zhì)量濃度1.0、4.0、8.0和16.0 mg/mL，未添加花椒提取物的液體培養(yǎng)基組作為陰性對(duì)照組。30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，離心(4℃、12 000 r/min，5 min)，上清液用等體積乙酸乙酯(含0.5%甲酸)萃取，保留上層有機(jī)相，于35 ℃旋蒸。蒸干后，用1 mL甲醇潤(rùn)洗燒瓶。所得粗提液置于-20 ℃保存。

AHLs檢測(cè)：將過夜活化的紫色桿菌CV026以2%體積分?jǐn)?shù)與100 mL冷卻至40 ℃ LB半固體培養(yǎng)基混合，同時(shí)加入卡那霉素(終質(zhì)量濃度20 mg/mL)，倒平板。待風(fēng)干后，打孔，加入30 μL AHLs粗提液。30 ℃培養(yǎng)過夜，觀察是否有紫圈及紫圈直徑大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 花椒提取物的抑菌活性及群體感應(yīng)抑制活性

向培養(yǎng)液中添加不同濃度的花椒提取物，觀察紫色桿菌CV026和嗜水氣單胞菌的生長(zhǎng)情況，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度為32.0 mg/mL，紫色桿菌CV026的最小抑菌濃度為8.0 mg/mL，后續(xù)試驗(yàn)均以花椒提取物的亞抑菌濃度進(jìn)行。花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌的試驗(yàn)質(zhì)量濃度為1.0、4.0、8.0和16.0 mg/mL，對(duì)紫色桿菌CV026的試驗(yàn)質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0和4.0 mg/mL。與對(duì)照組相比，添加不同濃度的花椒提取物后，圓孔周圍均出現(xiàn)渾濁、不透明的紫色色素抑制圈，且抑制圈的直徑隨著提取物濃度的升高而增大。由此說明，花椒提取物在不影響菌株生長(zhǎng)的情況下，對(duì)紫色桿菌CV026群體感應(yīng)具有一定抑制作用，這種作用呈濃度依賴性抑制。

a—對(duì)照；b—1.0 mg/mL；c—2.0 mg/mL；d—4.0 mg/mL圖1 花椒提取物對(duì)紫色桿菌CV026產(chǎn)紫色色素的抑制作用Fig.1 Inhibition of Z.bungeanum extract on violacein production of C.violaceum CV026

2.2 紫色色素的定量檢測(cè)

運(yùn)用酶標(biāo)法對(duì)紫色桿菌CV026紫色色素產(chǎn)量進(jìn)行定量分析，其產(chǎn)量降低程度可表明花椒提取物的群體感應(yīng)抑制活性強(qiáng)弱，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：在亞抑菌濃度下，花椒提取物對(duì)紫色桿菌CV026生長(zhǎng)無抑制作用。隨著花椒提取物濃度的升高，紫色桿菌色素產(chǎn)量呈濃度依賴性降低。當(dāng)花椒提取物質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，紫色色素產(chǎn)量?jī)H為對(duì)照產(chǎn)量的14.63%(P<0.05)。由此說明，在不影響菌株正常生長(zhǎng)代謝的前提下，花椒提取物對(duì)紫色桿菌CV026的群體感應(yīng)系統(tǒng)具有抑制作用。

圖2 花椒提取物對(duì)紫色桿菌CV026紫色色素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of Z.bungeanum extract on violacein production of C.violaceum CV026

2.3 花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的影響

圖3 花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的影響Fig.3 Effects of Z.bungeanum extract on biofilm formation of A.hydrophila

生物膜是細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中吸附于生長(zhǎng)基質(zhì)表面形成的一種與浮游細(xì)胞相應(yīng)的生物被膜，由菌體和自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成[16]。生物膜形成有利于細(xì)菌生長(zhǎng)及抗逆性產(chǎn)生。Chu等[17]研究表明群體感應(yīng)是嗜水氣單胞菌生物膜形成和毒力因子表達(dá)的重要調(diào)控機(jī)制之一。Rama等[18]發(fā)現(xiàn)迷迭香酸能有效抑制嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)介導(dǎo)的生物膜形成和毒力因子產(chǎn)生?？疾旎ń诽崛∥飳?duì)嗜水氣單胞菌生物膜的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在亞抑菌濃度下，花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)無明顯抑制作用。以對(duì)照組為基準(zhǔn)(生物膜相對(duì)抑制率為0)，隨著花椒提取物濃度的升高，菌株生物膜抑制率呈濃度依賴性升高。當(dāng)花椒提取物質(zhì)量濃度分別為8.0和16.0 mg/mL時(shí)，其生物膜抑制率為48.48%、72.11%，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。這表明，在不影響菌株正常生長(zhǎng)代謝的前提下，花椒提取物能夠抑制嗜水氣單胞菌生物被膜的形成，且抑制效果呈濃度依賴型。由此推測(cè)，花椒提取物中含有某些QSI活性成分，可通過干擾該菌群體感應(yīng)進(jìn)一步抑制生物膜形成。

2.4 花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌蛋白酶的影響

嗜水氣單胞菌可分泌胞外蛋白酶，將肉類、奶類食品中蛋白分解，造成食品變質(zhì)腐敗[19]。嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶活性的強(qiáng)弱與其本身的群體感應(yīng)系統(tǒng)密切相關(guān)，通過調(diào)控QS可延緩相關(guān)食品腐敗[20]?？疾旎ń诽崛∥飳?duì)嗜水氣單胞菌蛋白酶的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，與對(duì)照組相比，菌株胞外蛋白酶活性隨著花椒提取物濃度的升高而降低，這與梅永超等[21]研究結(jié)果相似。當(dāng)花椒提取物質(zhì)量濃度分別為8.0和16.0 mg/mL時(shí)，其相對(duì)蛋白酶活性僅為最初的31.01%、26.70%,抑制效果顯著(P<0.05)。

圖4 花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌蛋白酶活性的影響Fig.4 Effects of Z.bungeanum extract on protease activity of A.hydrophila

2.5 花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌泳動(dòng)的影響

泳動(dòng)是細(xì)菌遷移的一種重要方式，指細(xì)菌在小于0.45%的瓊脂培養(yǎng)基表面遷移[22]。Packiavathy等[23]研究發(fā)現(xiàn)，泳動(dòng)有利于細(xì)菌生物膜的形成以及細(xì)菌在宿主表面的黏附聚集[23]。圖5為不同花椒提取物用量對(duì)嗜水氣單胞菌泳動(dòng)能力的影響。由圖5可知，添加花椒提取物的處理組泳動(dòng)性明顯弱于對(duì)照組，泳動(dòng)直徑顯著減小，且泳動(dòng)直徑的大小與提取物添加量呈負(fù)相關(guān)。由此可見，花椒提取物能夠顯著抑制嗜水氣單胞菌泳動(dòng)性，阻礙菌株的遷移。

圖5 花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌泳動(dòng)性的影響Fig.5 Effects of Z.bungeanum extract on swimming motility of A.hydrophila

2.6 花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌產(chǎn)AHLs的影響

目前普遍接受的QSI的作用機(jī)制主要有3種：抑制信號(hào)分子合成、作為信號(hào)分子類似物，通過與受體蛋白結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制及直接降解信號(hào)分子[24]。香芹酮通過下調(diào)halI(AHL合成酶)基因的表達(dá)，減少信號(hào)分子產(chǎn)生，從而減弱H.alvei毒力因子表達(dá)[25]。槲皮素競(jìng)爭(zhēng)性抑制信號(hào)分子與受體蛋白LasR或PqsE的結(jié)合，從而抑制細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)[26]。嗜水氣單胞菌產(chǎn)C4-HSL 信號(hào)分子[13]。因此選用 CV026為報(bào)告菌株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖6，以其紫色圈直徑的大小可表示AHLs 的相對(duì)含量。

由圖6可知，花椒提取物處理組的紫色圈直徑均小于對(duì)照組，且呈現(xiàn)濃度依賴性。這表明，花椒提取物可通過減小AHLs產(chǎn)量調(diào)控細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，并進(jìn)一步調(diào)控相關(guān)特性的表達(dá)。而花椒提取物中的活性成分能否與菌株信號(hào)分子受體結(jié)合或降解信號(hào)分子，仍需進(jìn)一步探索。

圖6 花椒提取物對(duì)嗜水氣單胞菌AHLs產(chǎn)生的影響Fig.6 Effects of Z.bungeanum extract on AHLs production of A.hydrophila

3 結(jié)論

以紫色桿菌 CV026為研究菌株，證明了花椒提取物具有群體感應(yīng)抑制活性，能顯著抑制紫色桿菌CV026紫色色素的產(chǎn)生。花椒提取物可抑制嗜水氣單胞菌生物膜形成、胞外蛋白酶活性及泳動(dòng)作用，且抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性?；ń诽崛∥镲@著降低嗜水氣單胞菌AHLs的產(chǎn)生，推測(cè)花椒提取物可通過減少AHLs干擾嗜水氣單胞菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，從而調(diào)控相關(guān)性狀的表達(dá)。本研究證實(shí)了花椒提取物的群體感應(yīng)抑制活性，但目前花椒提取物所含的活性成分及其對(duì)腐敗菌QS調(diào)控的分子機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究，為其作為天然保鮮劑的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。