有機(jī)相中脂肪酶催化合成乙酸芳樟酯的研究

胡 坤，代 斌，胡建國，李 鑫，甄長慧　(蚌埠醫(yī)學(xué)院科研中心，安徽蚌埠 233000)

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有機(jī)相中脂肪酶催化合成乙酸芳樟酯的研究

胡 坤，代 斌*，胡建國，李 鑫，甄長慧(蚌埠醫(yī)學(xué)院科研中心，安徽蚌埠 233000)

摘要[目的]以乙酸酐和芳樟醇為底物，采用脂肪酶催化法合成乙酸芳樟酯。[方法]通過考察不同種類的脂肪酶對該反應(yīng)的催化效果，研究不同種類固定化載體對該脂肪酶活性的影響，探討固定化后的脂肪酶在有機(jī)相中催化合成乙酸芳樟酯的條件。[結(jié)果]獲得了一種對該反應(yīng)催化效率較高的脂肪酶Novozym 435，得出其最佳固定化條件，確定了固定化后的脂肪酶在有機(jī)相中催化合成乙酸芳樟酯的最佳反應(yīng)條件：異辛烷為最佳有機(jī)溶劑，以摩爾比為1∶1.5的芳樟醇和乙酸酐為底物，底物濃度為0.5 mol/L，在45 ℃下振蕩反應(yīng)24 h，此條件下乙酸芳樟酯的收率較高。[結(jié)論]該反應(yīng)體系的建立為今后工業(yè)生物催化法合成乙酸芳樟酯奠定了良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞有機(jī)相；乙酸芳樟酯；脂肪酶；固定化

乙酸芳樟酯，又名乙酸沉香酯、乙酸里那酯，化學(xué)名稱為3，7-二甲基-l，6-辛二烯-3-醇乙酸酯，有著類似薰衣草和鈴蘭等香精油的幽雅香氣，可從薰衣草中提取獲得。薰衣草在羅馬時代就被廣泛用作香草，被稱為“香草之后”，因其功效較多，香氣有著使人心曠神怡、清新舒暢的功效，自古被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和香水制作上。近代，薰衣草的主要成分乙酸芳樟酯又被廣泛用于配制皂用香精、香水香精、食品香精等多種香精，在日化、煙草和食品工業(yè)中也占有十分重要的地位[1]。

近年來，隨著我國日化、卷煙和食品等產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，對乙酸芳樟酯的需求也成倍增加。但是，因為自然資源有限，從天然植物中提取乙酸芳樟酯不僅提取流程相對復(fù)雜，而且產(chǎn)量也遠(yuǎn)不能滿足需求，所以采用化學(xué)方法對乙酸芳樟酯的合成進(jìn)行研究和提高乙酸芳樟酯的產(chǎn)率，具有著重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益。

有機(jī)相酶催化技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，隨著化學(xué)工藝的發(fā)展，有機(jī)相的酶催化動力學(xué)和酶固定化技術(shù)等都越來越受到重視；有機(jī)相中脂肪酶催化不僅可以用于油脂的水解來制備脂肪酸，而且還可用于對某些低質(zhì)油脂的改良。例如，可用于橄欖油與硬脂酸的脂交換，以制備類可可脂[2]。用于催化油脂和甘油之間的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，或脂肪酸和甘油的酯化反應(yīng)，以制備單酰甘油脂[3]。另外，還可利用脂肪酶的區(qū)域選擇性，催化高級脂肪酸和糖分子上的特定羥基發(fā)生酯化反應(yīng)，從而獲得采用一般化學(xué)方法難以制得的單酰糖酯[4]。此外，以脫氫芳樟醇為原料，采用先酯化后加氫的工藝路線制備乙酸芳樟酯，結(jié)果表明制備乙酸芳樟酯的工藝具有選擇性高、成本低的優(yōu)勢[5]。由此可見，有機(jī)相酶催化技術(shù)工業(yè)上的應(yīng)用將使傳統(tǒng)的化學(xué)工業(yè)朝著節(jié)約資源和能源的方向發(fā)展，具有非常廣闊誘人的前景。筆者在有機(jī)相中以乙酸酐和芳樟醇為底物，采用脂肪酶催化法合成乙酸芳樟酯，并比較了不同種類固定化載體對該脂肪酶活性的影響，確定最佳的固定化條件，并確定了固定化脂肪酶在有機(jī)相中催化合成乙酸芳樟酯的最佳條件，以期為其今后工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗材料與耗材。 米黑毛霉(Mucormiehei)，購自Novo Nordisk 公司；D101大孔樹脂(D101 macroporous resin)，購自天津市光復(fù)化工研究所；節(jié)桿菌Y-605(Arthrobacter Y-605)，由蚌埠醫(yī)學(xué)院科研中心實驗室分離并篩選；殼聚糖(Chitosan)，購自Sigma公司；脂肪酶(PocrinePanereasliPase(PPL)，購自Sigma公司；橄欖油(Olive oil)，購自國藥化學(xué)試劑有限公司；南極假絲酵母脂肪酶B(CdidaetieliPase B)，購自諾維信公司；磷酸氫二鉀和甘氨酸，均為分析純，購自西安化學(xué)試劑廠；乙酸酐，分析純，購自中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司；50%戊二醛，分析純，購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；芳樟醇，ω(芳樟醇)>97%，購自上海石化股份有限公司化工研究所；試驗中使用的氫氧化鈉、聚乙烯醇等需經(jīng)3A分子篩除水。

1.1.2儀器。回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜，為上海智誠分析儀器制造廠產(chǎn)品；恒溫磁力攪拌器，為上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)，為德國Eppendorf公司產(chǎn)品；Perkinelmer高效氣相色譜，為美國珀金埃尓默儀器有限公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)，為德國Christ公司產(chǎn)品。

1.2試驗方法

1.2.1脂肪酶固定化。固定化方法是使酶更廣泛、更有效應(yīng)用的一種重要手段。目前，國際上制備固定化酶的方法種類較多，比較成熟的固定化方法可大致分為吸附法[6]、交聯(lián)法[7]、包埋法[8]、共價結(jié)合法[9]4類。綜合考慮酶的制備過程、固定化酶狀態(tài)和載體來源等因素，對比后選擇采用涂布法和吸附法來進(jìn)行脂肪酶的固定化研究。①涂布法。取用一定量酶液，加入經(jīng)預(yù)處理的載體，攪拌均勻后30 ℃真空干燥后得到固定化酶。②吸附法。取用一定量酶液，加入經(jīng)預(yù)處理的載體，先經(jīng)過30 ℃搖床中振蕩4 h后抽濾，然后用緩沖溶液洗滌、干燥得到固定化酶。

1.2.2脂肪酶水解活力單位的測定。首先脂肪酶國際單位定義為：在測定條件下每分鐘釋放出1 μg分子脂肪酸的酶量。脂肪酶活力單位的測定選用聚乙烯醇橄欖油乳化液法[10]：用4 mL 4%的PVA(聚合度1750)橄欖油乳化液和5 mL的0.025 mol/L pH 7.0緩沖液1 mL酶液，在37 ℃下反應(yīng)15 min，加入15 mL的95%乙醇終止反應(yīng)，結(jié)果用0.05 mol/L NaOH溶液滴定，以酚酞為指示劑。

1.2.3固定化載體的選擇。載體對固定化脂肪酶活力的影響較大，用于固定化脂肪酶的可用載體也非常多。選用大孔樹脂、硅藻土、活性炭、殼聚糖作為初步載體進(jìn)行篩選，通過測定酶活力發(fā)現(xiàn)大孔樹脂的酶活明顯高于其他3種載體。因此，試驗中主要用大孔樹脂作為載體進(jìn)行其他條件的篩選。

1.2.4脂肪酶合成酯的反應(yīng)體系。在100 mL具塞三角瓶中加入反應(yīng)底物乙酸酐和芳樟醇，反應(yīng)底物乙酸酐和芳樟醇的摩爾比為1.2～1.5，同時加入有機(jī)溶劑，使底物濃度保持在0.2～1.0 mol/L，在33～50 ℃下振蕩反應(yīng)3～36 h。

1.2.5氣相色譜檢測產(chǎn)物的組成。使用美國Perkinelmer氣相色譜儀，DB-1毛細(xì)管柱，氫火焰FID檢測器，氮氣為載氣，柱溫條件為80 ℃，保持3 min，然后以15 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持2 min。

2結(jié)果與分析

2.1固定化條件的篩選

2.1.1載體加入量對固定化效果的影響。在粗酶量為400 mg、pH為8.0、固定化溫度30 ℃、濃度0.1 mol/L 的K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液中，比較不同大孔樹脂加入量對酶固定化效果的影響。從圖1可以看出，隨著載體用量的不斷增加，固定化酶的水解酶活呈先增大后減小的趨勢，因此選擇最佳的大孔樹脂加入量為2.5 mg/mg粗酶。

2.1.2緩沖液pH對酶固定化效果的影響。選用最佳大孔樹脂用量，以0.1 mol/L K2HPO4-KH2PO4為緩沖溶液，考察了不同pH的磷酸鹽緩沖溶液對酶固定化效果的影響。從圖2可以看出，當(dāng)pH為6.4時，酶固定化效果最好。

2.1.3不同緩沖溶液對酶固定化效果的影響。分別用K2HPO4-KH2PO4、甘氨酸-NaOH和 Na2HPO4-KH2PO4為緩沖溶液，在其他條件相同的情況下，比較3種緩沖溶液對吸附效果的不同影響。通過測定固定化酶水解活力后發(fā)現(xiàn)，用K2HPO4-KH2PO4的緩沖溶液來固定化脂肪酶效果最好。

2.2脂肪酶在水相和不同有機(jī)溶劑相中合成芳樟酯能力的比較用Novozym 435脂肪酶在同樣條件下于正庚烷、異辛烷、正己烷、正戊烷和水中合成己酸芳樟酯比較反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。從圖3可以看出，在異辛烷中催化合成的己酸芳樟酯轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)速度都高于在其他有機(jī)溶劑中的反應(yīng)結(jié)果，且遠(yuǎn)高于在水相中的反應(yīng)結(jié)果。究其原因，這是由于在有機(jī)相中酯化反應(yīng)熱力學(xué)平衡更容易向著合成酯的方向移動[11]。

2.3合成乙酸芳樟酯的最佳脂肪酶篩選由于酶的專一性不同，不同酶對反應(yīng)的催化效率也不同。比較了4種不同微生物來源的脂肪酶PPL、Y-605、MML和Novozym435，研究合成乙酸芳樟酯的結(jié)果。從圖4可以看出，由于不同的脂肪酶的酯活力不同，因此合成乙酸方樟酯轉(zhuǎn)化率也是不同的。其中，以Novozym435和MML酯化活力較高。

2.4不同試驗條件對合成乙酸芳樟酯的影響以異辛烷為有機(jī)溶劑，在45 ℃條件下振蕩反應(yīng)，通過正交試驗來考察不同試驗條件對合成乙酸芳樟酯的影響。通過高效氣相色譜實時檢測，得到乙酸芳樟酯的實時轉(zhuǎn)化率，發(fā)現(xiàn)底物濃度是最主要的影響因素，其次為底物摩爾比，酶加入量和水含量對試驗的影響相對較小。隨著反應(yīng)時間的不斷增加，乙酸芳樟酯的轉(zhuǎn)化率也在不斷提高，但是24～36 h內(nèi)乙酸芳樟酯的轉(zhuǎn)化率已無明顯提高，36 h的轉(zhuǎn)化率反而有所降低(表1)。因此，為了減少能耗和提高效率，選擇24 h作為最佳合成時間。

表1乙酸芳樟酯實時轉(zhuǎn)化率檢測

Table 1Detection of real-time conversion rate of linalyl acetate

3結(jié)論與討論

大孔樹脂是比較理想的固定化酶載體，該試驗以K2HPO4-KH2PO4為緩沖溶液，當(dāng)pH為6.4，樹脂與酶的質(zhì)量比為2.5∶1時，可以達(dá)到最佳固定化效果。通過高效氣相色譜對乙酸芳樟酯轉(zhuǎn)化率的檢測，筆者考察了固定化后的脂肪酶在有機(jī)相中催化合成乙酸芳樟酯的條件，確定其最佳反應(yīng)條件：當(dāng)以異辛烷作為有機(jī)溶劑，乙酸酐和芳樟醇摩爾比為1.5∶1，底物濃度為0.5 mol/L，在45 ℃條件下?lián)u床中振蕩反應(yīng)24 h，此條件下得到乙酸芳樟酯的收率較高。同時，脂肪酶的選擇和分批加入能較大程度地減少因酶失活對轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生的影響。此反應(yīng)的底物乙酸酐為強(qiáng)脫水劑，加入的脂肪酶容易由于乙酸酐的脫水作用，脫去脂肪酶周圍的水分包裹層，導(dǎo)致脂肪酶失活。為了減少因酶失活對轉(zhuǎn)化率的影響，采用將脂肪酶分批加入的方法，來保證新酶的持續(xù)供給。該試驗中，采用將脂肪酶分3次加入的方法，取得較好的效果。

該試驗利用微生物酶來催化乙酸芳樟酯合成，為今后工業(yè)生物催化法合成乙酸芳樟酯奠定良好的基礎(chǔ)。目前，以芳樟醇為原料合成乙酸芳樟酯，主要分為乙烯酮法和乙酸酐酯化法。乙烯酮法由于乙烯酮有毒，化學(xué)性質(zhì)活潑，反應(yīng)條件要求高[12]，所以研究較多的是乙酸酐酯化法。筆者在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步細(xì)化與改進(jìn)了反應(yīng)條件，同時選用比較合適的微生物酶作為催化劑。芳樟醇酯化反應(yīng)常用的催化劑有磺基水楊酸、磷鎢酸催化劑等，這些催化劑往往存在轉(zhuǎn)化率較低、反應(yīng)選擇性不高和反應(yīng)效果較差的缺點，例如有試驗在磺基水楊酸為催化劑的條件下得到的結(jié)果轉(zhuǎn)化率較低，同時副反應(yīng)較多；以磷鎢酸為催化劑時，需要在較高溫度下進(jìn)行長時間反應(yīng)，能耗相對較高。筆者對以上缺點有了相應(yīng)改進(jìn)，取得了較好的效果，但是轉(zhuǎn)化率依然不夠理想，今后研究中應(yīng)對多種不同脂肪酶進(jìn)行再次篩選，尋求更適合于乙酸芳樟酯合成的酶。

參考文獻(xiàn)

[1] 胡忠.微波輻射下乙酸芳樟酯的合成研究[J].化工技術(shù)與開發(fā)，2004(1)：1-3.

[2] MACRAE A R，KLIBANOV A M.Lipase-catalyzed interesterification of oils ad fats[J]J.Am Oil Chem Soc，1983，60(21)：291-294.

[3] JANSSEN A E M，VAN DER PADT A，VAN SONSBEEK H M，et al.The effect of organic solvents on the equilibrium position of enzymatic acylglycerol[J].Biotch，& Bioeng，1993，41(1)：95-103.

[4] THERISOD M，KLIBANOV A M.Enzymatic preparation of monoacylated sugars in pyridine[J].J Am Chem Soc，1986，108：5638-5640.

[5] 張蕊.乙酸芳樟酯合成工藝優(yōu)化[D].上海：華東理工大學(xué)，2014.

[6] ALLAL B，JACQUES F，JACQUES L，et al.Adsorption of succinylated，lysozyme on hydroxyapatite[J].Journal of colloid interface science，1997，189：37-42.

[7] QUINN Z，ZHOU K，CHEN X D.Immobilization of β-galactosidase on graphite surface by glutaraldehyde[J].Journal of food engineering，2001，48(1)：69-74.

[8] MARKVICHEVA E A，KUPTSOVA S V，MAREEVA T Y，et al.Immobilized enzymes and cells in poly(N-vinyl caprolactam)-based-hydrogels[J].Applied biochemical biotechnology，2000，88(123)：145-157.

[9] YESIM Y.Utilization of bentonite as a support material for immobilization ofCandidarugosalipase[J].Process biochemistry，2005，40：2155-2159.

[10] 秦昉.堿性脂肪酶測定方法的探討[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報，1998，17(1)：31-34.

[11] ZAKS A，KLIBANOV A M.Enzymatic catalysis in organic media at 100 ℃[J].Science，1984，224：1249-1251.

[12] AQUILA W，POX R，ETZRODT H． Preparation of acetatesof hydroxyl group-containing organics，in particular linalylacetate：US，6156926[P]．2000-12-05．

Research on Linalyl Acetate Catalyzed by Lipase in Organic Solvent

HU Kun, DAI Bin*, HU Jian-guo et al

(Bengbu Medical College, Bengbu, Anhui 233000)

Key wordsOrganic solvent; Linalyl acetate; Lipase; Immobilization

Abstract[Objective] To synthesize linalyl acetate by catalyzing substrate of acetic anhydride and linalool. [Method] Through investigating the catalysis effect of different kinds of lipases, the effect of different kinds of fixed carriers on the lipase activity were studied, the conditions in which the ester of acetic anhydride and linalool was catalyzed by the fixed lipase in organic solvent were explored. [Result] A lipase Novozym 435 which can catalyze the reaction most efficiently was obtained, as well as the best conditions for the fixation. The best conditions for the reaction were as follows: the best organic solvent must be isooctane; substrate of acetic anhydride and linalool should be 1∶1.5 by Mole; the concentration of the substrate must be 0.5 mol/L; the temperature should be 45 ℃; shaking reaction for 24 h. Under these conditions we can get linalyl acetate as much as possible. [Conclusion] The reaction system lays a solid foundation for synthesizing linalyl acetate in the bio-industry area in the future.

基金項目教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃項目(NCET-04-0988)；蚌埠醫(yī)學(xué)院重點科研項目(BYKY1494skZD)。

作者簡介胡坤(1984-)，男，山東臨沂人，助教，碩士，從事植物化學(xué)研究。*通訊作者，教授，博士，從事有機(jī)化學(xué)方面的研究。

收稿日期2016-01-22

中圖分類號S 132

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)07-001-03