國家重點研發(fā)計劃《新一代高通量數(shù)字PCR關(guān)鍵技術(shù)及應(yīng)用研究》簡介

蘭英 杜文斌 中國科學院微生物研究所，微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室

國家重點研發(fā)計劃《新一代高通量數(shù)字PCR關(guān)鍵技術(shù)及應(yīng)用研究》簡介

蘭英 杜文斌 中國科學院微生物研究所，微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室

數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)是繼實時熒光PCR（qPCR）之后的第三代定量核酸檢測技術(shù)[1]，可實現(xiàn)對核酸樣本的數(shù)字化絕對定量分析，突破了傳統(tǒng)PCR檢測在區(qū)分較小的拷貝數(shù)差異的局限，從而在低頻核酸突變檢測等領(lǐng)域具有革命性的優(yōu)勢。數(shù)字PCR的基本原理是：將稀釋的核酸樣品分配到大量獨立的微反應(yīng)單元，進行大規(guī)模單拷貝PCR擴增反應(yīng)和基于泊松分布（Poisson distribution）的絕對定量分析。簡單來說，數(shù)字PCR通過對海量微反應(yīng)單元的熒光信號進行讀取分析，可直接數(shù)出核酸分子的個數(shù)。與實時熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR具有很強的抗干擾能力和對多基因靶點的同時檢測能力，具有極高的定量精確性和靈敏度，在區(qū)分等位基因的差異性表達水平、檢測病毒感染載量、肺癌突變基因靶向分析以及檢測孕婦外周血中胎兒游離DNA等方面有廣闊的應(yīng)用潛力。

表1. 市場上數(shù)字PCR相關(guān)儀器比較

近年來，隨著微納加工及微流控技術(shù)的發(fā)展，使高通量的皮納升體積單拷貝反應(yīng)單元的快速生成、均一擴增條件控制和高通量檢測成為可能，這為數(shù)字PCR裝備的研發(fā)帶來了契機。目前主要的數(shù)字PCR技術(shù)可歸納為三種類型：（1）大規(guī)模集成流路技術(shù)（Integrated fuidic circuits，IFCs）：利用多層軟光刻工藝在聚二甲氧基硅烷（PDMS）上加工帶控制閥門的微管和微腔體，實現(xiàn)生物樣品的分液、混合、及PCR擴增。2006年美國 Fluidigm公司推出的首臺商品化數(shù)字PCR儀Bio-Mark便基于IFCs技術(shù)；（2）開放微孔陣列技術(shù)（Open Arrays）：在疏水基片上微加工開口的納升體積微孔陣列，利用微孔的親水化處理，通過點樣或浸泡等方法引入納升PCR反應(yīng)體系，進行大規(guī)模陣列反應(yīng)。如美國Life Technologies于2014年推出的QuantStudio 3D 數(shù)字PCR系統(tǒng)；（3）微滴微流控技術(shù)(droplet microfluidics)：利用微流控通道生成油包水微滴進行數(shù)字PCR擴增和分析。如2013年美國伯樂公司（Bio-Rad）推出的QX200 數(shù)字PCR儀，以及RainDance公司推出的Raindrop 數(shù)字PCR儀（見表1）。目前，國外數(shù)字PCR設(shè)備已經(jīng)有近10年的商業(yè)化進程，并且已經(jīng)全面進入中國市場。主流進口數(shù)字PCR儀器單價在百萬元人民幣左右，配套的耗材如芯片、試劑等價格不菲。短短幾年時間內(nèi)，眾多國外知名儀器廠商相繼推出數(shù)字PCR設(shè)備，數(shù)字PCR儀的研發(fā)無疑是當前分子診斷裝備領(lǐng)域的一個發(fā)展熱點，具有非常廣闊的市場前景。

數(shù)字PCR核酸分析相關(guān)技術(shù)研究最近幾年得到了國內(nèi)科研單位和相關(guān)企業(yè)廣泛的關(guān)注，有不少國內(nèi)研究機構(gòu)在開展相關(guān)工作[2]。如浙江大學[2]、北京大學[4]、中科院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所[5]、中科院半導體研究所[6]等單位也都在數(shù)字分子診斷微流控技術(shù)領(lǐng)域開展了高水平的工作。未來5～10年，是數(shù)字PCR臨床診斷應(yīng)用推廣的關(guān)鍵時期。因此，我們認為在基礎(chǔ)研究之外，急需加快我國自主知識產(chǎn)權(quán)數(shù)字PCR商品化設(shè)備的研發(fā)，避免在數(shù)字PCR技術(shù)臨床市場打開后，出現(xiàn)類似實時熒光PCR設(shè)備嚴重依賴進口的局面。

為了在技術(shù)和儀器研發(fā)等落后的條件下尋求突破，本項目集合了中國科學院微生物研究所、上海交通大學、東南大學和北京華金瑞清生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司等單位的優(yōu)勢力量，研究的目標是：針對現(xiàn)有數(shù)字PCR技術(shù)的瓶頸和不足，研發(fā)面向復(fù)雜臨床樣品的高通量自動化磁分離定量核酸提取技術(shù)，并利用獨創(chuàng)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的動態(tài)界面打印微滴陣列制備技術(shù)，實現(xiàn)低成本、高通量的微滴反應(yīng)單元陣列的制備以及大規(guī)模微滴陣列的實時熒光動態(tài)成像檢測，研究開發(fā)新一代高通量數(shù)字PCR裝備。項目下設(shè)四個課題，包括東南大學孫岳明教授的《自動核酸提取和高通量微滴陣列制備關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)》，上海交通大學電子信息與電氣工程學院陳迪教授的《大面積精確溫控模塊及核酸擴增芯片關(guān)鍵技術(shù)研究》，上海交通大學電子信息與電氣工程學院劉滿華副教授的《高通量實時圖像采集、處理與分析與算法研究和軟件開發(fā)》，以及中國科學院微生物研究所杜文斌研究員的《高通量數(shù)字 PCR 關(guān)鍵技術(shù)集成樣機開發(fā)與臨床驗證》。項目具體研究包括：

（1）針對臨床樣品分析，開發(fā)基于自動化磁分離的高通量陣列核酸提取技術(shù)。

數(shù)字PCR的定量精確性依賴于標準化的定量核酸提取技術(shù)的支撐。目前臨床診斷的生物樣品復(fù)雜的處理和制備過程，不僅耗時耗力，且使數(shù)字PCR的精確定量的可靠性因為核酸提取過程中的損失和污染而喪失。因此，本項目提出 “樣本提取—擴增制備—定量分析”全過程自動化和標準化操作的新思路。研究團隊東南大學在功能化納米磁性顆粒核酸純化方面具有豐富的前期積累，可以很好地實現(xiàn)從樣本中提取高質(zhì)量的核酸樣本。

（2）開發(fā)更加簡便和集成化的微體積反應(yīng)單元制備技術(shù)。現(xiàn)有微流控微滴生成技術(shù)依賴于昂貴的微加工芯片耗材，加工成本高，相關(guān)工藝的國產(chǎn)化尚未成熟。本研究團隊前期開發(fā)了新型動態(tài)界面打印均一微滴陣列制備技術(shù)7，可在96孔板上通過低成本的探針式打印耗材，不僅大大降低耗材開發(fā)的難度，降低成本，而且可以利用探針的二維陣列，實現(xiàn)大批量樣品的微滴陣列制備。

（3）大規(guī)模微滴陣列PCR溫控芯片系統(tǒng)和實時熒光動態(tài)成像系統(tǒng)的全新設(shè)計。

從陣列式設(shè)計出發(fā)，利用微滴的自動陣列排布、高精度的大面積半導體溫控以及基于自適應(yīng)閾值的微滴圖像快速自動提取和軌跡跟蹤分析模型算法，提高數(shù)字PCR的平行樣品處理通量，并提供更加準確的數(shù)字PCR擴增結(jié)果分析。

通過以上關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)以及樣機的研制，項目組將力爭早日開發(fā)出適合臨床應(yīng)用需求的國產(chǎn)數(shù)字PCR裝備。同時，項目組也高度重視與相關(guān)企業(yè)以及醫(yī)療機構(gòu)的合作，希望能夠通過臨床應(yīng)用來檢驗系統(tǒng)的可靠性、實用性和穩(wěn)定性。相信通過本裝備項目的實施，以及國內(nèi)數(shù)字PCR技術(shù)領(lǐng)域?qū)＜业墓餐?，能夠為國產(chǎn)數(shù)字PCR儀器的商品化開發(fā)打下堅實的基礎(chǔ)。在不遠的將來，希望國產(chǎn)化數(shù)字PCR儀能夠走進廣大基層醫(yī)院和檢驗機構(gòu)，在實現(xiàn)疾病的診斷和病情的監(jiān)控、指導個體化治療，尤其是病毒和細菌感染性疾病的診斷、優(yōu)生優(yōu)育、遺傳病篩查、腫瘤早期診斷等方面發(fā)揮巨大作用，為提升全社會的健康水平做出重大貢獻。

[1] Baker, M. Nat. Methods 2012, 9, 541-544.

[2] Ding, X.; Mu, Y. Chinese J. Anal. Chem. 2016, 44, 512-521.

[3] Zhu, Q.; Qiu, L.; Yu, B.; Xu, Y.; Gao, Y.; Pan, T.; Tian, Q.; Song, Q.; Jin, W.; Jin, Q.; Mu, Y. Lab Chip 2014, 14, 1176-1185.

[4] Men, Y.; Fu, Y.; Chen, Z.; Sims, P. A.; Greenleaf, W. J.; Huang, Y. Anal. Chem. 2012, 84, 4262-4266.

[5] Bian, X.; Jing, F.; Li, G.; Fan, X.; Jia, C.; Zhou, H.; Jin, Q.; Zhao, J. Biosens. Bioelectron. 2015, 74, 770-777.

[6] Li, Z.; Liu, Y.; Wei, Q.; Liu, Y.; Liu, W.; Zhang, X.; Yu, Y. PLoS One 2016, 11, e153359.

[7] Xu, P.; Zheng, X.; Tao, Y.; Du, W. Anal. Chem. 2016, 88, 3171-3177.