同種異體皮膚移植家兔灃射重組人IL—10后血清IL—17家族水平的變化觀察

魏聰 劉遠(yuǎn)程 趙容

[摘要]目的：觀察同種異體皮膚移植家兔注射重組人IL-10后血清IL-17家族水平的變化，探究重組人IL-10抑制免疫反應(yīng)的機(jī)制。方法：30只健康新西蘭白兔依據(jù)隨機(jī)平均原則分為A組[重組人IL-10低劑量組，5μg/（kg·d）]、B組[重組人IL-10高劑量組，10μg/（kg·d）]、C組[環(huán)孢菌素低劑量組，Smg/（kg·d）]、D組[環(huán)孢菌素低劑量組，lOmg/（kg·d）]、E組[重組人IL-10低劑量，5μg/（kg·d）+環(huán)孢菌素低劑量組，Smg/（kg·d）]、F組[生理鹽水空白對(duì)照組，0.9%氯化鈉溶液Iml/d]六組，每組5只，均經(jīng)肌肉注射于皮膚移植術(shù)前l(fā)d給藥，共給藥lOd，各組分別于術(shù)前l(fā)d，術(shù)后ld、4d、1周、2周、3周、4周取兔耳中動(dòng)脈血，分離制得血清后，依酶聯(lián)免疫法測定IL-17家族各成員（IL-17A-F）的濃度。結(jié)果：家兔同種異體皮膚移植術(shù)后IL-17A、IL-27（IL-17B/C/D）、IL-17E（IL-25）、IL-17F的濃度均高于術(shù)前，且在術(shù)后2周達(dá)到高峰，隨后逐漸降低；thlL-10能抑制IL-17A、IL-27、IL-17F的分泌，且抑制效應(yīng)隨著rhIL-10劑量的增多而加強(qiáng)；rhIL-10可促進(jìn)IL-25的分泌，但無明顯量效關(guān)系。結(jié)論：同種異體皮膚移植家兔注射rhIL-10后血清IL-17家族水平明顯提高，rhIL-10對(duì)免疫反應(yīng)的抑制作用可能與IL-17家族介導(dǎo)的炎性反應(yīng)及炎性因子分泌有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] IL-17家族；重組人IL-10；家兔；同種異體；皮膚移植；免疫排斥反應(yīng)

[中圖分類號(hào)]Q813.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2016）O1-0037-04

免疫排斥反應(yīng)是器官和組織移植術(shù)失敗的重要原因之一。環(huán)孢菌素（Cyclosporine A，CsA）等免疫抑制劑在抑制免疫排斥反應(yīng)的同時(shí)，多數(shù)產(chǎn)生較大的副作用。據(jù)報(bào)道，IL10能減弱免疫排斥反應(yīng)、提升機(jī)體的免疫耐受力，且已在肝移植術(shù)中證實(shí)，它不僅能延長移植物的存活時(shí)間，而且其副作用輕微。而IL-17家族已被證實(shí)參與器官移植排斥反應(yīng)等的發(fā)病機(jī)制。本研究觀察30只同種異體皮膚移植家兔注射重組人IL-IO（Recombinant human IL-IO，thIL-IO）后血清IL-17家族水平的變化，探究重組人IL-IO抑制免疫反應(yīng)的機(jī)制，以供移植術(shù)相關(guān)研究參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取30只健康的新西蘭白兔（四川醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），雌性17只，雄性13只，年齡90-120d，重量1.9-2.6kg，依據(jù)隨機(jī)平均原則分為A組（thIL-IO低劑量組）、B組（thIL-IO高劑量組）、C組（CsA低劑量組）、D組（CsA高劑量組）、E組（rhIL-1O低劑量+CsA低劑量組）、F組（生理鹽水空白對(duì)照組）六組，每組5只，各組用藥及劑量依次為thIL-IO （由北京方程佰金科技有限公司提供，國藥準(zhǔn)字：210910036）5μg/（kg.d）、thIL-1010μg/（kg·d）、CsA（生產(chǎn)廠家：北京艾然生物技術(shù)有限公司，國藥準(zhǔn)字：S56109559）5mg/（kg·d）、CsAlOmg/ （kg.d）、thIL-I0 5μg/（kg·d）+CsA 5mg/（kg·d）、0.9%氯化鈉溶液1ml/d，均經(jīng)肌肉注射于皮膚移植術(shù)前l(fā)d給藥，共給藥lOd。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

兔血清IL-17家族酶聯(lián)免疫試劑盒（上海撫生實(shí)業(yè)有限公司），全自動(dòng)酶聯(lián)儀洗板機(jī)（型號(hào)：DNX9620A，南昌普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司），全自動(dòng)酶聯(lián)儀（型號(hào)：SS228BEPIII，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司），離心機(jī)（型號(hào)：周182487，北京東西儀科技有限公司）。

1.3 動(dòng)物模型

同種異體皮膚移植術(shù)按照文獻(xiàn)進(jìn)行。

1.4 兔血清IL-17家族各成員濃度的測定

分別于術(shù)前l(fā)d，術(shù)后ld、4d、1周、2周、3周、4周采集兔耳中動(dòng)脈血4.Oml，離心機(jī)（3000r/min，15min）分離血清以備用，按照酶聯(lián)免疫法測定其血清中IL-17 A-F的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.O對(duì)收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用百分率（oh）表示，兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，P

2 結(jié)果

2.1 家兔皮膚移植前后血清IL-17A的濃度

如表1，A-E 5組術(shù)前IL-17A的濃度均低于術(shù)后濃度（P<0.05），在術(shù)后2周達(dá)到高峰，隨后逐漸降低；除F組與C組術(shù)后4d的差異無顯著性外，F(xiàn)組術(shù)后1-2ld IL-17A的濃度高于其余四組，經(jīng)比較，差異顯著（P<0.05）；A組術(shù)后1-2ld IL-17A的濃度高于B組， 經(jīng)比較，差異顯著（P<0.05）；與E組相比，A組IL-17A的濃度在術(shù)后ld、4d、2周差異顯著（P<0.05），C組IL-17A的濃度在術(shù)后1-14d差異顯著（P<0.05）：在術(shù)后ld，C組IL-17A的濃度低于A組，且差異顯著（P<0.05），而此時(shí)B組與D組相比，差異無顯著性（P>0.05），其余時(shí)間點(diǎn)而言，A組與C組、B組與D組之間IL-17A濃度的差異均無顯著性（P>0.05）。見表1。

2.2 家兔皮膚移植前后血清IL-17B/C/D（IL27）的濃度

如表2，在各組術(shù)前IL27的濃度與術(shù)后的對(duì)比中，除B組術(shù)后ld與術(shù)前的差異無顯著性（P>0.05）外，其余各組術(shù)后IL27的濃度均高于術(shù)前濃度（P<0.05），在術(shù)后2周達(dá)到高峰，隨后逐漸降低；F組術(shù)后1-14d IL27的濃度高于A-E 5組（P0.05）。見表2。

2.3 家兔皮膚移植前后血清IL-17E （IL25）的濃度

如表3，A-E 5組術(shù)前IL-17E的濃度均低于術(shù)后濃度，相比于術(shù)前，A、B、D三組在術(shù)后4-14d升高（P<0.05），C組在術(shù)后4-28d升高（P<0.05），E組在術(shù)后4-2ld升高（P<0.05），F(xiàn)組在術(shù)后第ld升高（P<0.05）；在術(shù)后的1周和2周，A-E 5組IL-17E的濃度高于F組，經(jīng)比較，差異顯著（P

2.4 家兔皮膚移植前后血清IL-17F的濃度

如表4，6組術(shù)前IL-17F的濃度均低于術(shù)后濃度，在術(shù)后2周達(dá)到高峰，隨后逐漸降低；相比于術(shù)前，B組在術(shù)后4-28d IL-17 F的濃度才明顯增加（P<0.05），而其余5組在術(shù)后1-28d即明顯增加（P<0.05）；B組IL-17F的濃度在術(shù)后ld-2ld低于F組（P<0.05），其余5組在術(shù)后1-14d低于F組（P<0.05）；在術(shù)后1-14d，B組IL-17F的濃度低于A組（P<0.05）；與E組相比，A組IL-17F的濃度在術(shù)后ld、4d、2周明顯提高（P<0.05），而C組在術(shù)后ld-14d明顯提高（P<0.05）；在術(shù)后ld，C組IL-17F的濃度低于A組（P<0.05），D組IL-17F的濃度低于B組（P<0.05），A組與C組、B組與D組在其它時(shí)間點(diǎn)對(duì)比的差異均無顯著性（P>0.05）。見表4。

3 討論

IL-17A是IL-17家族的成員之一，由155個(gè)氨基酸構(gòu)成，氨基端有約20個(gè)氨基酸殘基，其基因定位于6p12，與IL-17F定位接近，二者不僅有一半左右的同源性和類似的生物學(xué)功能，且均由輔助性T細(xì)胞活化后產(chǎn)生。IL-17A和IL-17F在活化單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的同時(shí)，使其集中分布于移植物的表面，從而參與免疫排斥反應(yīng)。IL27大多由活化的單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞等分泌，通過與IL2、IL-12共同作用于自然殺傷細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌INF-γ，而INF-γ通過增強(qiáng)1型輔助性T細(xì)同種異體皮膚移植術(shù)后血清胞功能，進(jìn)而參與免疫排斥反應(yīng)。本研究中，家兔同種異體皮膚移植術(shù)后IL-17A、IL27、IL-17F的濃度均高于術(shù)前，且在術(shù)后2周達(dá)到高峰，隨后逐漸降低，推測術(shù)后早期的免疫排斥反應(yīng)有IL-17A、IL27、IL-17F等的參與，這與戴小波等的研究結(jié)果吻合。進(jìn)一步分析家兔皮膚移植術(shù)后血清IL-17家族濃度發(fā)現(xiàn)，A、B兩組低于F組，且B組低于A組，這提示thIL-IO能抑制IL-17A、IL27、IL-17F的分泌，且抑制效應(yīng)隨著thIL-IO劑量的增多而加強(qiáng)。目前，多數(shù)研究指出，IL-IO對(duì)IL-17A、IL-17F分泌的抑制作用是通過抑制IL6和促進(jìn)IL-IO、IL4的分泌來實(shí)現(xiàn)的；另外，IL-IO不僅可抑制單核細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞分泌前炎性細(xì)胞因子，而且對(duì)IL27的生成有明顯的抑制作用。另外，本研究中，A組、C組IL-17A、IL27、IL-17F的濃度均高于E組（P<0.05），這提示CsA 與thIL-IO在IL-17A、IL27、IL-17F的抑制作用方面具有協(xié)同作用。

IL-17E與以上有所不同，一方面，它與IL-17的同源性較小，約為17.5%，是此家族中同源性最小的一員；另一方面，其生物學(xué)功能也與其它成員有較大的差別，其抗炎作用主要通過抑制1型輔助性T細(xì)胞、17型輔助性T細(xì)胞的生長及二者細(xì)胞因子的產(chǎn)生過程來實(shí)現(xiàn)。本研究中，A、B兩組IL-17E濃度的峰值顯著高于F組，且其差異顯著（P<0.05），提示thIL-IO不僅能促進(jìn)2型輔助性T細(xì)胞生長，而且對(duì)IL-17E的分泌過程也有促進(jìn)作用，但I(xiàn)L-17E在本研究中參加免疫排斥反應(yīng)的機(jī)制無法明確。

綜上所述，同種異體皮膚移植家兔注射thIL-IO后血清IL-17家族水平明顯提高，thIL-IO對(duì)免疫反應(yīng)的抑制作用可能與IL-17家族介導(dǎo)的炎性反應(yīng)及炎性因子分泌有關(guān)。