microRNA—130a抑制KGN細胞FOXL2基因的表達及對細胞增殖的影響

李亞玲 張偉 梁惠宇 周陸陸 姚永明 唐勝建

[摘要]目的：研究外源性microRNA-130a在卵巢顆粒細胞KGN中過表達對FOXL2基因表達的影響，探索microRNA-130a對KGN細胞增殖的影響。方法：人工設計合成靶向FOXL2基因的microRNA-130a模擬物，脂質體法將microRNA-130a模擬物轉染入KGN細胞中，Trizol法和RIPA蛋白裂解法分別獲取高純度的細胞總RNA和總蛋白，實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應（FQ-PCR）檢測microRNA模擬物轉染后細胞中FOXL2基因mRNA表達水平，Western Blot檢測FOXL2蛋白表達水平，四甲基偶氮唑鹽法（MTT）檢測microRNA-130a轉染后KGN細胞的增殖情況。 結果：成功轉染KGN細胞后，陰性對照組FOXL2基因mRNA和蛋白的表達水平與空白對照組相比無明顯的差異（P>0.05），miR-130a轉染組能顯著抑制FOXL2 mRNA和蛋白的表達，與空白對照組和陰性對照組相比均有統(tǒng)計學差異（p<0.05）。MTT法檢測各組KGN細胞的OD值及細胞增值率，microRNA-10a轉染后能明顯促進KGN細胞的增殖，與與空白對照組和陰性對照組相比均有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。結論：外源性的miR-130a對FOXL2基因mRNA和蛋白表達有明顯的抑制作用，且能明顯促進KGN細胞的增殖。

[關鍵詞] miR-130a；轉染；KGN細胞：FOXL2；基因表達調控；細胞增殖

[中圖分類號]Q813.1

[文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）01-0030-04

FOXL2是叉頭框轉錄因子家族成員之一，主要表達在眼周、卵巢和垂體細胞中，該基因最早由Crisponi作為小瞼裂綜合征（BPES，Blepharophimosis Syndrome，MIM： 110100）及卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）的候選基因被克隆定位Ⅲ。小瞼裂綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，臨床上以瞼裂狹小，上瞼下垂，反向性內眥贅皮和內眥遠距為主要征象，BPES根據是否存在卵巢早衰分為兩型，I型合并有卵巢早衰（premature ovarianfailure，POF），II型只表現(xiàn)為眼瞼畸形，超過2/3的BPES患者攜帶有FOXL2的基因內突變，此外FOXL2的雜合突變還能導致卵巢功能早衰和女性不孕。FOXL2作為轉錄因子功能的發(fā)揮需要FOXL2基因本身的磷酸化激活，發(fā)生FOXL2基因突變的體細胞FOXL2功能失活，研究證實FOXL2基因突變能夠促進細胞的增殖，以及抑制細胞的凋亡。

microRNA是生物體內源長度約為21-25個核苷酸的非編碼小分子RNA[7]，microRNA通過與靶mRNA的3端非編碼區(qū)域（3-untranslatedregion，3UTR）互補配對導致mRNA的翻譯抑制或降解，從而在轉錄水平上對基因的表達進行負調控。microRNA對維持生物體正常的生理功能具有重要的意義，microRNA在體內的異常表達與人類許多疾病有關，包括一些精神疾以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等，生物信息學研究表明生物體內超過60%的蛋白編碼基因受體內靶向microRNA的調控。

鑒于microRNA對基因的調控功能以及FOXL2是小瞼裂綜合癥的致病基因，本研究利用生物信息學研究工具篩查出在小瞼裂綜合癥中異常表達的microRNA，人工設計合成miR-130a mimics，將miR-130a mimics瞬時轉染入卵巢顆粒細胞KGN中，研究miR-130a mimics對FOXL2基因表達的調控作用，以及對KGN細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

KGN細胞株由濰坊醫(yī)學院整形外科實驗室保存，DMEM培養(yǎng)液、OptiMEM ReducedSerum Medium、Lipofectamine3000 Reagent、新生牛血清、MTT細胞增殖試劑均購自美國GIBCO（Invrotrigen）公司。microRNAmlmics由英濰捷基（上海）貿易有限公司提供，逆轉錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNAeraser（Perfect Real Time）和熒光定量PCR試劑MightyAmpfor Real Time（SYBR Plus）（2×）均購自日本的Takara公司，Western Blot抗FOXL2基因的一抗、二抗均購自上海優(yōu)寧維生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：人卵巢顆粒細胞癌KGN細胞株貼壁生長于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO₂恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，實驗選取處于指數生長期的細胞。

1.2.2 細胞轉染和熒光顯微鏡觀察：實驗分為空白對照組、陰性對照組（microRNA-130a Negative controlmlmics組）和microRNA-130a mimics轉染組，轉染前24h將KGN細胞以1×lOb-3×105的數目接種于6孔板中，以每孔7.5μl的lip3 000和7.5μg的microRNA mimics轉染細胞，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于轉染8h、12h、24h、36h、48h，取出6孔板在倒置熒光顯微鏡下進行觀察。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測：轉染48h后收集每孔中的KGN細胞，按Trizol一步法提取細胞總RNA，用微量分光光度計測量RNA的濃度和純度，設計20μl逆轉錄反應體系。以逆轉錄反應中獲得的cDNA為模板，GAPDH為內對照，設計25μl PCR擴增體系，在熒光定量PCR儀按98℃5min，98℃30s，60℃30s，68℃30s，擴增40個循環(huán)。PCR擴增結束后，以2-△△Ct表示目的mRNA的相對表達量。實驗重復三次以上。

1.2.4 Western Blot檢測：細胞轉染48 h后收集各孔KGN細胞，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞并提取細胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。取蛋白25μg/孔，以10%SDSPAGE跑膠分離，轉PVDF膜，室溫封閉2h，以FOXL2和GAPDH為一抗（抗體稀釋比例分別為1∶5000和1∶500），4℃孵育過夜，洗膜，過氧化物酶耦聯(lián)的二抗（稀釋比例均1∶500）室溫標記1h，ECL法顯影，掃描曝光后的膠片，采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白FOXL2和內參GAPDH條帶的灰度值的比值表示目的蛋白FOXL2的相對表達水平。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖情況：取指數生長期的KGN細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后計數，按3×10¹⁰細胞/孔的濃度接種于96孔板中，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，瞬時轉染microRNA mimics入細胞中。分別于轉染0、24、48和72h，用MTT法檢測細胞增殖情況。吸去待測細胞上清液，加入180 ll1無血清培養(yǎng)液，再加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清液，每孔加入100μlDMSO，置于搖床上低速振蕩lOmin，使結晶充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀于490nm波長處測量各孔的吸光度（OD）值，以細胞培養(yǎng)時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞增殖曲線，計算細胞增殖率。細胞增殖率=實驗組OD值/陰性對照組OD值，繪制KGN細胞增殖率曲線。實驗重復3次。

1.2.6 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件對實驗結果數據進行統(tǒng)計學分析。計量數據以均數±標準差表示，兩樣本均數比較采用雙側t檢驗，檢驗水準為a=0.05，以P

2 結果

2.1 熒光顯微鏡觀察結果

熒光顯微鏡下，可見2種質粒在轉染8h后即可出現(xiàn)清晰的綠色熒光，24h后發(fā)生綠色熒光的細胞數目進一步增加，48h后達到最高峰，72h時熒光數量下降（圖1）。

2.2 熒光定量PCR檢測結果

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，與空白對照組相比，陰性對照組FOXL2的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），miR130a轉染組FOXL2 mRNA的表達量明顯下降，與空白對照組和陰性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖2）。

2.3 Western Blot檢測結果

蛋白印跡法檢測結果顯示，與空白對照組相比，陰性對照組FOXL2蛋白的表達量下降了8.796，表達量無明顯的下降，差異不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05），miR-130a轉染組FOXL2蛋白的表達量與空白對照組相比下降了40.9%，與陰性對照組相比下降了35.3%，與空白對照組與陰性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。

2.4 MTT法檢測細胞增殖

MTT法檢測結果顯示，與空白對照組組比較，陰性對照組KGN細胞的增殖能力無明顯的改變（圖3），差異無統(tǒng)計學意義。miR-130a mimics轉染組能顯著促進細胞的增殖，與空白對照組與陰性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P

3 討論

microRNA作為一類可調控基因表達的內源性小分子RNA，在多種疾病中發(fā)揮重要作用，microRNA調控基因表達的功能與來源無關，microRNA調控體內大部分的蛋白編碼基因，WANG等研究報道利用分子生物學工具預測到整個miR30家族成員都參與FOXL2基因的調控，且在COV434細胞系中敲除Ag02能夠上調FOXL2基因的表達，這項研究進一步說明，microRNA參與FOXL2基因的表達，且在實驗中證實miR_30a下調FOXL2基因的表達，miR30a通過抑制FOXL2基因的表達，上調BCL2AI和IER3基因的表達16。Dai等研究表明microRNA-133b參與FOXL2的表達，能夠通過抑制FOXL2基因的表達上調雌激素合成相關基因CYP19AI和StAR的表達，從而促進雌激素的合成。

鑒于microRNAs參與FOXL2基因的表達調控，本研究通過生物信息學工具篩查出在小瞼裂綜合征中異常表達的microRNA，人工設計合成microRNA-130a mimics，瞬時轉染入KGN細胞中，研究microRNA-130a mimics對FOXL2基因的表達調控，實驗結果表明，在KGN細胞中過表達microRNA-130a能夠顯著抑制FOXL2基因的表達，F(xiàn)OXL2mRNA和蛋白的表達量顯著下降，說明microRNA-130a參與FOXL2基因的調控，己知FOXL2基因與人類的小瞼裂綜合征以及卵巢早衰等疾病有關，參與人類的顱面部和生殖系統(tǒng)的發(fā)育，F(xiàn)OXL2是第一個被認定在維持卵巢功能中具有重要作用的常染色體基因，也是性別決定和分化的標記，F(xiàn)OXL2的突變可引起B(yǎng)PES和卵巢早衰。各種研究表明該基因在生物體中作用的發(fā)揮受到其自身表達調控的影響，而對其表達調控的研究和探索將為查明其作用的分子機制奠定基礎，本研究利用外源性microRNA-130a對FOXL2基因進行調控，為小瞼裂綜合征的致病基因調控提供新的研究思路。

microRNA參與細胞的增殖調控，趙等研究發(fā)現(xiàn)，miR20a在宮頸癌患者中的表達較正常人高，能夠促進宮頸癌細胞的增殖，分化與遷移。Uda等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2突變體小鼠的卵巢中濾泡細胞閉鎖，表明該基因在某種程度上有抗細胞凋亡的作用。FOXL2作為轉錄抑制因子能夠抑制BCL2AI、IER3和cyclinD2基因在卵巢顆粒細胞中的表達，BCL2AI和IER3是細胞凋亡抑制因子，cvclinD2是一種細胞周期調節(jié)基因，能夠促進細胞由G1期向S期轉變。WANG等研究報道m(xù)iR30a通過抑制FOXL2基因的表達促進BCL2AI、IER3和cvclinD的表達，進而促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，在睪丸腫瘤和卵巢腫瘤中BCL2AI、IER3和cyclinD2基因處于高表達狀態(tài)，從而導致腫瘤細胞的無限增殖?；诖?，本研究在microRNA-130a過表達能顯著抑制FOXL2基因表達的基礎上，又進一步探討microRNA-130a過表達對KGN細胞的增殖影響，MTT法檢測結果表明microRNA-130a過表達能夠明顯促進KGN細胞增殖，已知卵巢顆粒細胞參與了卵泡的發(fā)生以及雌激素的合成，卵泡細胞閉鎖能夠導致卵巢早衰，從而引發(fā)女性的閉經、不孕不育以及一系列由于體內雌激素缺乏所引起的癥狀，如潮熱多汗、面部潮紅等，卵巢顆粒細胞的增殖能夠減緩卵泡細胞的閉鎖，最重要的是能夠促進雌激素的合成，能明顯緩解體內雌激素缺乏所引起的一系列臨床癥狀。

綜上所述，本研究結果表明在卵巢顆粒細胞KGN中過表達microRNA-130a，能夠顯著抑制FOXL2基因的表達，并能有效促進KGN細胞的增殖，揭示了microRNA-130a、FOXL2以及細胞增殖之間的關系，microRNA-130a對FOXL2基因的表達調控不僅為FOXL2的突變研究提供新的思路，還為FOXL2基因缺陷性疾病小瞼裂綜合征的治療提供新的治療方向，microRNA-130a通過抑制FOXL2的表達促進KGN細胞的增殖，與FOXL2基因的低表達發(fā)揮協(xié)同作用，共同促進雌激素的合成，雌激素合成量的增加能夠有效緩解小瞼裂綜合征I型中的卵巢早衰癥狀。microRNA-130a對FOXL2的表達調控具有重要的基礎研究價值及臨床應用價值，而關于microRNA-130a通過何種機制促進KGN細胞的增殖則需要進一步的研究探索。