響應面法研究β-環(huán)糊精微波協(xié)同提取甘草黃酮的工藝研究

任光明，葛雪琴（忻州師范學院化學系，山西忻州034000）

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響應面法研究β-環(huán)糊精微波協(xié)同提取甘草黃酮的工藝研究

任光明，葛雪琴
（忻州師范學院化學系，山西忻州034000）

摘要：用β-CD微波協(xié)同提取甘草中的黃酮，在單因素試驗基礎上采用響應面（RSM）分析法，考察β-CD用量、微波功率、料液比、微波時間、乙醇體積分數(shù)、對黃酮提取率的影響。單因素試驗確定最佳提取條件為：甘草∶β-CD（質(zhì)量比）為1∶0.8、微波功率200 W、料液比1∶30（g/mL）、微波提取時間150 s、乙醇體積分數(shù)60 %；響應面法試驗優(yōu)化結(jié)果為：微波功率200 W、微波提取時間145s、料液比1∶32（g/mL）。

關(guān)鍵詞：甘草；黃酮；微波提取；響應面法

甘草又名粉草、蜜草、甜草等，屬植物的干燥根，甘草味干、平，性溫、微涼，無毒。藥用價值歷史悠久[1]，功能主治清熱解毒，祛痰止咳、益氣補中等。在中草藥中具有眾藥之王的美譽。其主要成分有甘草酸、甘草黃酮類、甘草多糖類化合物。隨著現(xiàn)代醫(yī)學對甘草研究的深入，發(fā)現(xiàn)甘草中黃酮類物質(zhì)有抗炎、抗病毒、強心、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用；后又發(fā)現(xiàn)它們能抗氧化、抗衰老、抗腫瘤。另外，甘草黃酮對糖尿病和肥胖也有一定預防作用[2]。甘草主要生長在法國、意大利、西班牙、伊拉克、伊朗、前蘇聯(lián)各加盟共和國以及中國[3]。

環(huán)糊精（CD）具有疏水性的內(nèi)腔和親水性的表面，是超分子化學中的基礎物質(zhì)之一，它具有的包合特性使其在理論和實際應用中得到迅速發(fā)展[4]。尤其在醫(yī)藥方面，CD和CD衍生物與傳統(tǒng)藥物載體材料相比，無毒，性質(zhì)穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)獨特，可用于提高藥物溶解度和穩(wěn)定性，增強藥物利用率[5]。這樣，方法簡便，效果明顯，便于工藝加工。

目前已有多種方法用于提取和測定黃酮，其中微波輔助提取就是一種快速有效的方法。微波輔助提取，又稱微波萃取，Microwave Extraction（ME）或Microwave Assisted Extraction（MAE），它是微波和傳統(tǒng)的溶劑萃取法相結(jié)合后形成的一種新的萃取方法[6]。由于微波有很強的穿透性、高的加熱效率和破碎植物細胞壁的能力，這樣不僅提高了提取效率，縮短了提取時間，還能大大節(jié)約能源。另一方面微波的快速高溫處理可以將細胞內(nèi)某些降解有效成分的酶滅活，從而使這些有效成分在藥材保存或提取時間內(nèi)不會遭到破壞。所以微波萃取法具有萃取時間短，溶劑用量少，提取率高，溶劑回收率高，所得產(chǎn)品品質(zhì)好，成本低，投資少等優(yōu)點，廣泛用于食品、化學合成、分析、環(huán)保等領(lǐng)域[7]。本文選取了β-CD為提取介質(zhì)，采用單因素和響應面法試驗確定了微波輔助提取黃酮的優(yōu)化條件，直接用可見分光光度法測定其含量，并為提取黃酮的工業(yè)生產(chǎn)提供了重要的試驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器和材料

1.1.1儀器

LWMC-201型可調(diào)功率微波化學反應器：南京陵江科技開發(fā)公司；725可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.1.2原料

甘草：由忻州惠康藥店提供，粉碎，過篩，裝瓶待用。

1.1.3試劑

亞硝酸鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市申泰化學試劑有限公司；硝酸鋁（分析純）、β-環(huán)糊精（分析純）：天津市光復精細化工研究所；試驗所用其他試劑為分析純，試驗用水為二次蒸餾水。

1.2試驗方法

1.2.1微波萃取法

準確稱量1.000 0 g的已粉碎的甘草和0.800 0 g β-CD加入100 mL的圓底燒瓶中，加入30mL的60 %乙醇，放入微波爐，在微波功率為200 W，輻射累計達150 s后，將提取液冷卻過濾，除去物料后將所得濾液用60 %乙醇定容到50 mL容量瓶刻度處。

1.2.2總黃酮的測定方法

用移液管吸取2 mL黃酮提取液于10 mL的比色管中，加5 %亞硝酸鈉溶液0.2 mL，搖勻后放置6 min，加10 %硝酸鋁溶液0.2 mL，搖勻后放置6 min，加4 %氫氧化鈉溶液2.0 mL，再用60 %氫氧化鈉的乙醇溶液定容，搖勻后放置15 min。在最大吸收峰510 nm波長處測定其吸光度，計算黃酮的含量。

甘草總黃酮得率的計算公式：

甘草總黃酮得率/%=（濾液中黃酮含量/所用甘草重）×100[8]

1.2.3響應面法（response surface methodology，RSM）

采用多元二次回歸方程擬合與響應值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求工藝函數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法[9]。

2結(jié)果與討論

2.1標準曲線的繪制

稱取蘆丁標準品15.00 mg置于50 mL的容量瓶中，加入60 %的乙醇使之溶解，再加入60 %的乙醇定容至刻度，搖勻，即得蘆丁標準溶液，每1 mL含無水蘆丁0.300 0 mg。吸取蘆丁標準溶液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，分別置于10 mL比色管中，加5 %亞硝酸鈉溶液0.2 mL，搖勻后放置6 min，加10 %硝酸鋁溶液0.2 mL，搖勻后放置6min，加4%氫氧化鈉溶液2.0mL，再加入60 %的乙醇定容至刻度，搖勻，后放置15 min。在最大吸收峰510 nm波長處測定其吸光度[10]，所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得回歸方程為：Y=9.926 4X + 0.016 5，式中：X為被測樣中黃酮的質(zhì)量；Y為吸光度，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

2.2單因素試驗

2.2.1不同介質(zhì)對甘草中黃酮得率的影響

稱取處理好的1.000 0 g已粉碎的甘草3份分別置于3個100 mL圓底燒瓶中。分別加入30 mL 60 %乙醇、0.800 0 g β-CD、0.800 0 g HP-β-CD，按1.2.1的方法提取，在510 nm處測定其吸光度。計算黃酮的含量（見表1）。

表1不同介質(zhì)中黃酮的得率Table 1 The flavonoids extraction rate of different medium

由表1知，微波輔助β-CD提取甘草中黃酮效果最佳。

2.2.2 β-CD用量對得率的影響

準確稱量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它條件不變，只改變β-CD用量，甘草β-CD（質(zhì)量比）為1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1，按1.2.1節(jié)方法提取并在510 nm處測定其吸光度，計算黃酮的含量，見圖1。

從圖1可以看出，隨著β-CD用量的增加，得率有明顯增加。但當增加至0.8000 g后，再增加β-CD用量，得率沒有進一步增大，故選擇最佳β-CD用量為0.800 0 g。

圖1 β-CD用量對得率的影響Fig.1 Effect of β- cyclodextrin amount on the yield

2.2.3微波功率對得率的影響

準確稱量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它條件不變，只改變微波功率為（160、200、240、280、320 W）按1.2.1的方法提取并在510 nm處測定其吸光度，計算黃酮的含量，見圖2。

圖2微波功率對得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on the yield

從圖2可看出，微波功率在160 W~200 W內(nèi)，得率隨著微波功率的增大有明顯增加。但當微波功率增大到50 %以上時，隨著微波功率的增大，得率下降。故選擇200 W為最佳微波提取功率。

2.2.4料液比對得率的影響

準確稱量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它條件不變，只改變液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/ g）按1.2.1節(jié)方法在510 nm處測定其吸光度，計算黃酮的含量得率，見圖3。

圖3液料比對得率的影響Fig.3 Effect of ratio of material to liquid on the yield

從圖3可看出，在料液比為1∶30（g/mL）的條件下，得率達最大值，繼續(xù)增加料液比，得率明顯下降，故選擇1∶30（g/mL）為最佳料液比。

2.2.5時間對得率的影響

準確稱量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它條件不變，只改變微波輻射時間為（60、90、120、150、180s），按1.2.1節(jié)方法在510 nm處測定其吸光度，計算黃酮的含量，見圖4。

圖4時間對得率的影響Fig.4 Effect of time on the yield

從圖4可看出，隨著微波輻射時間的增加，得率有明顯的增加，但當增至150 s后，得率隨著輻射時間的增加而減少，故選擇150 s為最佳微波輻射時間。

2.2.6乙醇體積分數(shù)對得率的影響

準確稱量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它條件不變，只改變乙醇的體積分數(shù)為50 %、60 %、70 %、80 %、90 %，按1.2.1節(jié)方法在510 nm處測定其吸光度，計算黃酮的含量，見圖5。

圖5乙醇濃度對得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the yield

從圖5可看出，乙醇體積分數(shù)在40 %~60 %內(nèi)，得率隨著乙醇體積分數(shù)的增大有明顯增加。但當乙醇體積分數(shù)增大到60 %以上時，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，得率下降，在80 %有小幅度上升，但考慮耗能等因素。故選擇60 %為最佳乙醇體積分數(shù)。

2.3響應曲面優(yōu)化試驗

2.3.1響應曲面設計

在單因素試驗的基礎上[最優(yōu)條件為：β-CD用量為0.800 0 g、微波功率200 W、輻射時間150 s、料液比1∶30（g/mL）、乙醇體積分數(shù)60 %]，采用Box-Behnken設計方案做響應曲面研究，3個自變量微波功率、提取時間、料液比分別以X1，X2和X3代表，以+1，0，-1分別代表各自的不同水平，編碼因素及水平、試驗設計方案見表2。

2.3.2模型建立及顯著性檢驗

響應面設計試驗中，以微波功率、提取時間、料液比為參數(shù)，黃酮得率為響應值，進行三因素三水平響應曲面分析試驗。試驗結(jié)果見表3。

表2響應面法分析因素及水平Table 2 Analytical factors and levels for response surface methodology analysis

表3響應面分析試驗方案和結(jié)果Table 3 Experiment design and results of response surface methodology

利用Design Expert 7.0.0軟件對數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到黃酮得率（Y）對編碼自變量：微波功率（X1）、提取時間（X2）、液料比（X3）之間的二次多項回歸方程：

回歸方程系數(shù)及顯著性檢查見表4。

表4回歸方程系數(shù)及顯著性檢查Table 4 Regression coefficient and significance test

續(xù)表4回歸方程系數(shù)及顯著性檢查Continue table 4 Regression coefficient and significance test

從表4黃酮得率回歸模型方差分析（ANOVA）可以看出：F回=243.599 3，P<0.000 1，表明本試驗所選用的二次多項式模型具有高度的顯著性與實際試驗擬合較好。模型的R2=0.996 8，模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.992 7，表明僅有不到0.8 %的黃酮提取率的總變異不能由此模型來解釋。同時，由表4可見，一次項中X1，X2顯著；交互項中X2X3極顯著，二次項中X12，X22，X32極顯著。

Design Expert軟件中Box-Benhnken法[11]計算甘草中黃酮得率回歸模型的調(diào)整系數(shù)（Adj R-squared）Adj R2=0.996 8，即該模型能解釋99.68 %響應值的變化，表示該模型擬合程度良好，且試驗誤差小，說明響應面法優(yōu)化甘草中黃酮的提取條件是可行的。

2.3.3響應曲面分析

利用Design Expert 7.0.0軟件對表3數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及響應曲面見圖6~圖8。

根據(jù)二次模型所得到的等高線及響應面可以評價試驗因素之間的交互作用程度，以及確定各因素的最佳水平范圍。

由圖6可知：當料液比為1∶30（g/mL），提取時間不變的條件下，微波功率在160 W~200W范圍內(nèi)增大時，甘草中黃酮得率增加，并在200 W附近達到極大之后降低，與單因素試驗結(jié)果吻合。提取時間的影響不大，曲面比較平滑。

由圖7可知：微波功率、料液比的影響都顯著，兩個曲面都比較陡。等高線呈圓形，說明兩因素作用很強，影響顯著[12]。

由圖8可知：微波功率固定的條件下，液料比不變的情況下，甘草中黃酮得率受提取時間的影響不太顯著，表現(xiàn)為曲面比較平緩，先升高后平緩降低的曲線。

圖6微波功率、提取時間的等高線和響應曲面圖Fig.6 Contour and response surface plots for the effects of microwave power and extraction time on the yield of flavonoids

圖7微波功率、液料比的等高線和響應曲面圖Fig.7 Contour and response surface plots for the effects of microwave power and liquid-to-solid on the yield of flavonoids

圖8提取時間、液料比的等高線和響應曲面圖Fig.8 Contour and response surface plots for the effects of extraction time and liquid-to-solid on the yield of flavonoids

由圖6~圖8可以看出等高線呈橢圓，說明提取時間和微波功率、微波功率和液料比、液料比和提取時間之間交互影響顯著[13]，響應面陡峭說明提取得率對提取時間、微波功率和液料比的變化敏感[8]。

對回歸方程求導，并令其等于零，可以得到曲面的最大點，即3個因素的最佳水平值，轉(zhuǎn)換后得到提取的最佳條件為甘草∶β-CD（質(zhì)量比）為1∶0.8，微波功率200 W，提取時間145 s，料液比1∶32（g/mL），此時甘草中黃酮的得率達1.484 %。

2.4模型驗證

對試驗進行驗證，選擇的條件為甘草∶β-CD（質(zhì)量比）為1∶0.8、微波功率200 W、微波提取時間145s、料液比1∶32（g/mL），黃酮得率分別為1.472 %，1.462 %，1.402 %，平均為1.445 %，相對誤差為2.6 %，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好，偏差不大，吸光度測定值穩(wěn)定說明每次測定的黃酮含量穩(wěn)定，說明該結(jié)果是合理可靠的。

3結(jié)論與展望

本文以甘草為原料，運用現(xiàn)代的微波提取技術(shù)，采用可見分光光度計對甘草中黃酮的含量進行了測定，獲得結(jié)論如下：

在單因素試驗的基礎上通過響應面法的優(yōu)化，獲得微波輔助β-CD介質(zhì)提取甘草中黃酮的最佳工藝條件：甘草∶β-CD（質(zhì)量比）為1∶0.8，微波功率200 W，提取時間145 s，料液比1∶32（g/mL），此時甘草中黃酮的得率達1.484 %。模型經(jīng)驗證后結(jié)果穩(wěn)定，表明響應曲面法更好地反映了各因素對得率的影響，以及因素間的相互作用強度，是一種比較好的優(yōu)化工藝的方法。

黃酮類化合物是甘草中一類重要的活性成分。在甘草的根、葉中，均含有數(shù)量相當可觀的黃酮類化合物，具有開發(fā)利用價值。如何有效地提取這些化合物成為中藥研究的關(guān)鍵技術(shù)之一，文中數(shù)據(jù)為進一步開發(fā)和利用黃酮這一自然資源提供了重要的試驗依據(jù)。

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Research of Microwave and β-Cyclodextrin Coassisted Extraction Licorice Flavonoids by Response Surface Method

REN Guang-ming，GE Xue-qin
（Department of Chemistry，Xinzhou Teachers University，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

Abstract：On the basis of single factor experiment using the response surface method，microwave-assisted extraction of licorice flavonoids with β-CD as media was investegated. The impact factor，such as the amount of β-CD，microwave power，solid-liquid ratio，microwave time and the concentration of ethanol were determined，the optimum extraction conditions was as follows：the amount of beta-CD 0.800 0 g，microwave power 200 W，solid-liquid ratio 1∶30（g/mL），microwave extraction time 150 s，the concentration of ethanol 60 %；response surface method for experimental optimization results as follows：microwave power 200 W，the microwave extraction time 145 s，the solid-liquid ratio of 1∶32（g/mL）.

Key words：licorice；flavonoids；microwave extraction；response surface method

收稿日期：2014-07-23

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.027

作者簡介：任光明（1963—），男（漢），教授，本科，從事分析化學教學與科研工作。

基金項目：忻州師范學院化學化工創(chuàng)新實踐基地（院政字201331）；大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目（2013328）