中心組合效應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化鹽酸小檗堿包合物的制備

徐 霞，李 收

藥學(xué)

中心組合效應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化鹽酸小檗堿包合物的制備

徐 霞，李 收

目的 探討中心組合效應(yīng)面設(shè)計(jì)在優(yōu)化鹽酸小檗堿-β-環(huán)糊精包合物過(guò)程中的應(yīng)用。方法以鹽酸小檗堿為模型藥物，應(yīng)用中心點(diǎn)效應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD），采用飽和水溶液法制備鹽酸小檗堿-β-環(huán)糊精包合物，通過(guò)相溶解度圖法，溶出速度及飽和溶解度的測(cè)定對(duì)所制備的包合物進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果通過(guò)CCD設(shè)計(jì)建立二項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型所優(yōu)化包合物的處方為藥物與包合材料的比例為1∶2.03，包合時(shí)間為2.29 h。包合常數(shù)為263.01 L/mol。與鹽酸小檗堿相比較，溶解度可以提高2.98倍。結(jié)論CDD設(shè)計(jì)可認(rèn)為是尋求鹽酸小檗堿-β-環(huán)糊精包合物的最佳制備工藝，形成包合物后可顯著提高藥物的溶解度。

鹽酸小檗堿；β-環(huán)糊精；包合物；中心組合效應(yīng)面設(shè)計(jì)

小檗堿（Berberine）為從黃連、黃柏等中藥中分離的喹啉類(lèi)生物堿，以鹽酸鹽的形式用藥，主要治療腸道感染、菌痢等疾病。但鹽酸小檗堿味道極苦、水溶性差導(dǎo)致生物利用度低的特點(diǎn)，限制了其在臨床中的應(yīng)用［1，2］。因而有必要通過(guò)制劑方法掩蓋藥物的苦味以增加其順應(yīng)性，同時(shí)改善或提高藥物的溶解度和生物利用度。文獻(xiàn)報(bào)道采用將鹽酸小檗堿與β-環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊精飽和水溶液法制備成的包合物的方法可以實(shí)現(xiàn)上述目的［3，4］。

中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）是國(guó)內(nèi)外近年來(lái)應(yīng)用較多的一種實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法，為制劑制備工藝建立設(shè)計(jì)空間，通過(guò)非線(xiàn)性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量的輸入變量和工藝參數(shù)之間的多維組合與相互作用，具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、精度高、預(yù)測(cè)性好等優(yōu)點(diǎn)［5］。故本次實(shí)驗(yàn)采用中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化鹽酸小檗堿包合物的制備工藝。

1 儀器與試劑

磁力攪拌器 （上海司樂(lè)儀器有限公司）；UV-2550紫外分光光度計(jì)（日本島津）；電子天平（上海精科天平）；鹽酸小檗堿（東北制藥廠，純度：98.7%，批號(hào)20141218）；β-環(huán)糊精 （安徽山河藥用輔料有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸小檗堿β-環(huán)糊精包合物的制備 將β-環(huán)糊精加熱溶解在適量水中，將溶解在少量無(wú)水乙醇中的鹽酸小檗堿緩緩滴入冷卻至40℃的β-環(huán)糊精水溶液中，在400 r/min磁力攪拌不同時(shí)間后，冷卻至室溫，置冰箱中冷藏12 h，減壓濾過(guò)，分別用蒸餾水和丙酮洗滌，將濾渣30℃真空干燥，得到固體包合物。

采用紫外分光光度法測(cè)定包合物中鹽酸小檗堿的含量。精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品14.3mg，用70%的乙醇為溶劑配制成系列濃度的溶液，以70%的乙醇作為空白對(duì)照，在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果表明鹽酸小檗堿在230 nm，266 nm及342 nm處有最大吸收值，而環(huán)糊精在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)無(wú)吸收，考慮近紫外區(qū)的末端吸收影響，故選擇342 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為C=0.0709A－0.006，r=0.9998，表明鹽酸小檗堿在2.86～14.30 μg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，精密度、回收率等符合方法學(xué)考察要求。精密稱(chēng)取干燥后的包合物0.05 g，加70%乙醇超聲溶解后按紫外分光光度法測(cè)定鹽酸小檗堿含量，采用下列公式計(jì)算包封率和載藥量。

2.2 處方優(yōu)化設(shè)計(jì) 在單因素考察實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)包合物制備工藝影響顯著的兩個(gè)因素，即藥物與β－環(huán)糊精/比例（m/m）（X1）、包合時(shí)間（X2）為因素，以所制備包合物的包合率（Y1）和載藥量（Y2）為指標(biāo)，分別采用CCD設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)［6］。見(jiàn)表1、2。

表1 CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平安排表

表2 CCD設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表（n=3）

按照CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，將因素與響應(yīng)值進(jìn)行方程擬合，并以置信度（P）作為模型判定標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合二次多項(xiàng)式方程表達(dá)式為：

其中Y為響應(yīng)值（包封率、載藥率），A為方程系數(shù)，X為各自變量編碼值。

經(jīng)F值檢驗(yàn)顯示方程顯著（P=0.0006＜0.05），表明該回歸模型的擬合情況良好，能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)實(shí)際包封率。

經(jīng)F值檢驗(yàn)顯示方程顯著 （P=0.01937＜0.05），表明該回歸模型的擬合情況良好，能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)實(shí)際載藥量。

圖1 不同因素對(duì)響應(yīng)值影響的效應(yīng)曲面圖

從效應(yīng)曲面圖中可以看出，隨藥物與β－環(huán)糊精用量比例增加時(shí)，包封率呈先增加后降低趨勢(shì)，意味著在包合鹽酸小檗堿的過(guò)程中，所選擇的藥物與環(huán)糊精比例存在一個(gè)極值，通過(guò)對(duì)效應(yīng)面的分析能判斷各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。隨包合時(shí)間的延長(zhǎng)，包封率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，另從包封率的回歸方程來(lái)看，經(jīng)F值檢驗(yàn)顯示方程顯著，說(shuō)明所選擇的兩個(gè)因素的不同水平在該范圍內(nèi)對(duì)包合率影響有顯著性影響。從載藥量的回歸方程來(lái)看，經(jīng)F值檢驗(yàn)顯示方程顯著，表明該回歸模型的擬合情況良好，代表性較好，能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)實(shí)際情況。隨藥物與β－環(huán)糊精用量比例增加時(shí)，載藥量呈降低趨勢(shì)且變化趨勢(shì)較大；在包合時(shí)間對(duì)載藥量的影響過(guò)程中，載藥量也呈減少趨勢(shì)，提示在最佳處方附近，效應(yīng)與因素之間的關(guān)系變得非常敏感，實(shí)驗(yàn)條件的微小變化會(huì)造成指標(biāo)的較大改變，效應(yīng)和因素在此區(qū)域內(nèi)的關(guān)系一般表現(xiàn)為非線(xiàn)性，因此可通過(guò)預(yù)先設(shè)定目標(biāo)對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化。

在包合物制備過(guò)程中，希望所制備包合物的包封率和載藥量值越大越好，即希望兩者存在著極大值；采用Design Expert 8.06軟件對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化，得出最優(yōu)處方為鹽酸小檗堿∶β－CD用量比例為1∶2.03，包合時(shí)間為2.29小時(shí)為最佳制備工藝。

2.3 包合物的驗(yàn)證

2.3.1 相溶解度圖法 精密稱(chēng)取β－環(huán)糊精0.75 g置于50 ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度。然后將β－環(huán)糊精溶液以蒸餾水稀釋成濃度分別為1.5×10－3、3.0×10－3、4.5×10－3、6.0×10－3、7.5×10－3mol/L的溶液。取上述β－環(huán)糊精溶液各4.0 ml分別置具塞玻璃管中，均加入過(guò)量小檗堿，在25℃下振搖72h，8000 r/min離心10 min，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，紫外分光光度法測(cè)定鹽酸小檗堿的濃度。以β－環(huán)糊精溶液的濃度為橫坐標(biāo)，小檗堿的濃度為縱標(biāo)做相溶解度圖，并求出回歸方程。根據(jù)回歸方程，計(jì)算包合常數(shù)K，計(jì)算公式為其中b為回歸方程的斜率，S0為截距。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 鹽酸小檗堿在β-環(huán)糊精溶液中的相溶解度圖

結(jié)果表明在0～7.5×10－3mol/L濃度范圍內(nèi)，隨著β－環(huán)糊精溶液濃度的增加，小檗堿的濃度也相應(yīng)增大，兩者呈線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Y＝0.3698X＋0.0022（r2＝0.9998）的AL型，并且曲線(xiàn)的斜率b= 0.3698，b值＜1，說(shuō)明有藥物與環(huán)糊精之間按1∶1摩爾的結(jié)合比形成［7］。計(jì)算所得到的包合常數(shù)K值為263.01 L/mol。

2.3.2 溶出速率法 稱(chēng)取制得的包合物、物理混合物、小檗堿原料適量（相當(dāng)于小檗堿100 mg）置于溶出杯中，以900 ml蒸餾水作為溶出介質(zhì)，設(shè)定溫度為37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為100 r/min，分別于2、5、10、15、20、30、45 min定時(shí)取樣5 ml，同時(shí)補(bǔ)充同溫同體積的蒸餾水。取出的液體用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，濾液在342 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程，計(jì)算累積溶出度［3］。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，累積溶出度為縱坐標(biāo)，繪制藥物累計(jì)釋放曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。包合物的累積溶出度明顯高于混合物和鹽酸小檗堿，并在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，混合物的累積溶出度稍高于小檗堿，說(shuō)明包合物的制備能夠提高藥物的溶出度。

圖3 鹽酸小檗堿包合物、物理混合物及原料藥的溶出度測(cè)定結(jié)果

2.3.3 飽和溶解度測(cè)定 分別稱(chēng)取鹽酸小檗堿、包合物、物理混合物適量置10 ml容量瓶中，加蒸餾水制成飽和溶液，然后置于25℃恒溫振蕩器中振蕩72 h。將溶液在10000 r/min離心，取上清液用0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)，棄去初濾液，續(xù)濾液以紫外分光光度法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算飽和溶解度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 鹽酸小檗堿飽和溶解度測(cè)定結(jié)果

由表3可知，鹽酸小檗堿形成包合物后其飽和溶解度可提高2.98倍。說(shuō)明通過(guò)β－環(huán)糊精的包合作用，小檗堿的親水性顯著提高。而飽和溶解度的增加不僅僅是由于環(huán)糊精的加入引起，與物理混合物相比，形成包合物后的溶解可以提高1.6倍。

3 討論

藥物與載體的投料比直接影響藥物的包合率及載體材料的利用率。主、客分子之間的比例大，會(huì)造成載藥量小，藥物的有效濃度低；主、客分子之間的比例小，會(huì)使藥物未能全部被包合，游離藥物多，造成包合率較低。因而本試驗(yàn)中采用CCD效應(yīng)曲面模型進(jìn)行分析，基于非線(xiàn)性模式進(jìn)行設(shè)計(jì)，將復(fù)雜的未知的函數(shù)關(guān)系在小區(qū)域內(nèi)用二次多項(xiàng)式模型來(lái)擬合，以?xún)?yōu)化最佳處方。

該實(shí)驗(yàn)采用飽和水溶液法制備小檗堿-β-環(huán)糊精包合物，并采用CCD設(shè)計(jì)對(duì)處方進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)相溶解圖、藥物溶出速率及飽和溶解度的測(cè)定對(duì)是否形成包合物進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)制備成包合物，能顯著提高藥物的溶解度和溶出速度。因此在此基礎(chǔ)上，可將包合物作為中間體，進(jìn)一步制備成其他制劑，擴(kuò)大鹽酸小檗堿的應(yīng)用范圍。關(guān)于掩蓋味道方面，由于缺少相應(yīng)的合理的檢測(cè)方法，需在以后的工作中進(jìn)一步完善。

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［2016－02－19收稿，2016－03－13修回］ ［本文編輯：劉一洋］

Optimization of berberine and β-cyclodextrin inclusion compound preparation by central composite design

XV Xia①，LI Shou.①Dept.of Pharmacy，No.401 Hospital of Jinan Military Command of Chinese PLA，Qingdao，Shandong 266071，China

Objective To investigate application of central composite design（CCD）to optimize berberineβ-cyclodextrin inclusion compound.MethodsCCD optimization method was performed during the preparation of berberine-β-cyclodextrin inclusion compound.The inclusion compound was tailored according to saturated aqueous solution method.The product was validated via phase solubility diagram，dissolution rate and saturated solubility. The binding constant at 25℃ was calculated．ResultsThe optimal conclusion can be inferred from CCD. Multivariate quadratic equations were used to analyze interaction effects between the multivariate factors.The ratio of drug∶β-cyclodextrin served as 1∶2.03，and the including period was 2.29 h，respectively. The binding constant was 263.01 L/mol at 25℃．The solubility of inclusion compound was 2.98 times compared with raw berberine.ConclusionCCD was suitable to optimize the formulation of preparation of inclusion compound.The berberineβ-cyclodextrin inclusion compound exerts superior performance in improving dissolution properties.

Berberine；β-cyclodextrin；Inclusion compound；Central composite design

R918

A

10.14172/j.issn1671-4008.2016.09.025

266071山東青島，解放軍401醫(yī)院藥劑科 （徐霞）；277500山東棗莊，山東棗莊科技職業(yè)學(xué)院（李收）