MALDI-TOF MS在臨床微生物檢測中的應(yīng)用

閻萍 王萍 王旭暉

臨床研究

MALDI-TOF MS在臨床微生物檢測中的應(yīng)用

閻萍 王萍 王旭暉

目的探討應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間技術(shù)質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)在臨床微生物快速檢測中的應(yīng)用價值。方法收集新疆昌吉回族自治州人民醫(yī)院近兩年的分離菌株525株，分別分離自痰、尿、血液、分泌物、膿液等臨床標(biāo)本，其中革蘭陰性(G-)細(xì)菌225株，革蘭陽性(G+)細(xì)菌225 株，酵母菌75株。將MALDI-TOF MS與VITEK2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)(VITEK2 Compact)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果G-細(xì)菌鑒定符合率為96.4%(217/225)，G+細(xì)菌鑒定符合率為94.2% (212/225)，酵母菌鑒定符合率為94.7%(71/75)。結(jié)論MALDI-TOF MS技術(shù)快速、簡便、準(zhǔn)確且價格低廉，在快速鑒定臨床常見病原菌方面，尤其是在危重癥患者的快速檢測方面具有廣闊的應(yīng)用前景，為臨床救治爭取了寶貴的時間。然而目前該技術(shù)的應(yīng)用仍有一定的局限性，其檢測的準(zhǔn)確性受被測菌純度、實驗操作等影響，且對某些菌種的鑒定準(zhǔn)確性不高，對病毒檢測的過程較復(fù)雜［1］，因此MALDI-TOF MS技術(shù)仍需進(jìn)一步的探索研究。

微生物;基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間技術(shù)質(zhì)譜;快速檢測

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)是近年發(fā)展起來的一種新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)。臨床可以采用MALDI-TOF MS技術(shù)對常見病原菌進(jìn)行快速鑒定。目前，微生物鑒定主要依靠生化反應(yīng)鑒定，但鑒定周期長、費用高，且能力有限，分子生物學(xué)鑒定方法雖然準(zhǔn)確，但成本昂貴且費時，不適合大量樣本的鑒定。MALDI-TOF MS是一項用來鑒定和分析蛋白的技術(shù)，Holland等［2］發(fā)現(xiàn)，利用MALDI-TOF MS分析細(xì)菌全細(xì)胞時可檢測到大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，并根據(jù)細(xì)菌的圖譜鑒定未知細(xì)菌。本研究對525株菌株采用MALDI-TOF MS與全自動微生物分析系統(tǒng)(VITEK2 Compact)進(jìn)行同步試驗，比較2種鑒定技術(shù)的符合性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集新疆昌吉回族自治州人民醫(yī)院近兩年臨床分離菌株525株，菌株來源包括痰液、尿液、血液、分泌物、膿液等。

1.2 質(zhì)控菌株 金黃色葡萄球菌ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC8739、光滑假絲酵母菌ATCC MYA-2950，質(zhì)控菌株購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.3 儀器與試劑 MALDI-TOF VITEK MS系統(tǒng)，VITEK2 Compact自動鑒定儀，以及GN、GP、NH和YST鑒定卡，均由法國Biomrieux公司生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 所有菌株標(biāo)本接種在相應(yīng)培養(yǎng)基上(5%羊血瓊脂、巧克力培養(yǎng)基)，35℃孵育箱恒溫培養(yǎng)24～48 h(生長條件有特殊要求的菌置于5% CO2培養(yǎng)箱中)。

1.4.2 細(xì)菌的生化鑒定 采用VITEK2 Compact自動鑒定儀及配套鑒定卡，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.4.3 細(xì)菌的MALDI-TOF MS鑒定 質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC8739涂到校準(zhǔn)靶點上，干燥后加1 μL VITEK MS-CHCA基質(zhì)，用無菌接種環(huán)取適量純培養(yǎng)菌落涂在靶板點位中，加1 μL VITEK MS-CHCA基質(zhì)(酵母菌需先加0.5 μL VITEK MS-FA試劑處理，干燥后再加1 μL VITEK MS-CHCA基質(zhì))，待干燥后放入VITEK MS儀器中獲取細(xì)菌全細(xì)胞蛋白(主要是核糖體蛋白)質(zhì)譜，然后將待鑒定菌質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫中已知菌質(zhì)譜進(jìn)行比較，分析從而獲得結(jié)果。VITEK MS系統(tǒng)可得到從0%到99.9%的匹配百分率，匹配百分率≥70%時結(jié)果可信度高，匹配百分率＜ 70%認(rèn)為其無法提供鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 MALDI-TOF MS與VITEK2 Compact鑒定結(jié)果革蘭陽性(G+)細(xì)菌鑒定符合率為94.2%(212/225);革蘭陰性(G-)細(xì)菌鑒定符合率為96.4%(217/225);酵母菌鑒定符合率為94.7%(71/75)。見圖1。

2.2 MALDI-TOF MS與VITEK2 Compact G+細(xì)菌鑒定結(jié)果 在225株G+細(xì)菌中212株匹配百分率≥70%，鑒定符合率為94.2%(212/225);13株匹配百分率＜ 70%，包括1株溶血葡萄球菌、2株無乳鏈球菌、3株咽峽炎鏈球菌、3株口腔鏈球菌、2株鶉雞腸球菌。見表1。

圖1 臨床微生物常見病原菌的質(zhì)譜圖

表1 MALDI-TOF MS與VITEK2 Compact G+細(xì)菌鑒定結(jié)果比較

2.3 MALDI-TOF MS與VITEK2 Compact G-細(xì)菌鑒定結(jié)果 在225株G-細(xì)菌中217株匹配百分率≥70%，鑒定符合率為96.4%(217/225);8株匹配百分率＜ 70%，包括3株肺炎克雷伯菌、2株陰溝腸桿菌、2株摩根摩根菌、1株洋蔥伯克霍爾德菌。見表2。

2.4 MALDI-TOF MS與VITEK2 Compact酵母樣真菌鑒定結(jié)果 在75株酵母樣真菌中71株匹配百分率≥70%，鑒定符合率為 94.7%(71/75)，4株匹配百分率＜ 70%，包括2株克柔假絲酵母菌、2株近平滑假絲酵母菌。見表3。

表2 MALDI-TOF MS與VITEK2 Compact G-細(xì)菌鑒定結(jié)果比較

表3 MALDI-TOF MS與VITEK2 Compact酵母樣真菌鑒定結(jié)果比較

3 討論

MALDI-TOF MS是近幾年快速發(fā)展起來的一項應(yīng)用于細(xì)菌全細(xì)胞快速檢測的技術(shù)，一種新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)。MALDI的原理是利用激光照射標(biāo)本與基質(zhì)形成共結(jié)晶膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給標(biāo)本中的生物分子，并將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子而使生物分子發(fā)生電離。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同而被檢測，待測離子的質(zhì)荷比(M/Z)與離子的飛行時間成正比。最終結(jié)果是獲得指紋圖譜，通過對代表某種菌株特定表型的生物標(biāo)志物進(jìn)行分離分析，通過建立新的蛋白質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，或利用已有蛋白質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中的信息，比較待測菌株與標(biāo)準(zhǔn)參考菌株的質(zhì)譜圖而對微生物的種屬進(jìn)行鑒定［3-6］。

MALDI-TOF MS對葡萄球菌、腸球菌及部分腸桿菌鑒定符合率可達(dá)95%以上，但MALDI-TOF MS 與VITEK2 Compact在α溶血鏈球菌的鑒定符合率較低。另外，由于鶉雞腸球菌和鉛黃腸球菌的同源性較高，因此二者不易區(qū)分。在腸道致病菌中，MALDI-TOF MS分析法不能區(qū)分大腸埃希菌和志賀菌，鑒定結(jié)果顯示為大腸埃希菌時也可能是志賀菌，應(yīng)考慮患者的臨床情況和病史，并通過血清學(xué)試驗確定鑒定結(jié)果，有研究認(rèn)為這是志賀菌屬與大腸埃希菌的基因組相似造成的。因此，為提高M(jìn)ALDI-TOF MS對細(xì)菌的鑒定能力，儀器生產(chǎn)商有必要對圖譜數(shù)據(jù)庫逐步完善。由于菌株來源多樣、地域來源有差異，每一菌種特定譜圖的采集應(yīng)參考多個同種菌株。

Conway等［7］研究了培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)時間對大腸埃希菌的影響，結(jié)果表明培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)時間影響生物標(biāo)記分子的出現(xiàn)，甚至不同培養(yǎng)基引起質(zhì)譜圖的變化相當(dāng)于不同菌株間的區(qū)別。本研究選用哥倫比亞血瓊脂和巧克力平板。

MALDI-TOF MS用于臨床微生物的鑒定具有快速、準(zhǔn)確、方便、低成本的優(yōu)越性，較傳統(tǒng)的鑒定方法快16～18 h，為細(xì)菌性感染患者，特別是重癥患者的救治爭取到寶貴的時間，具有很好的應(yīng)用前景［8］，然而某些菌種尚未收錄在質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)致我們在檢測過程中受到限制，因此我們只有不斷的探索研究完善數(shù)據(jù)庫才能更好地應(yīng)用這項新技術(shù)。

1 曲芬，毛遠(yuǎn)麗.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀的臨床應(yīng)用體會.實用檢驗醫(yī)師雜志，2015，7:243-245.

2 Holland RD，Wilkes JG，Rafil F，et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Common Mass Spectrom，1996，10:1227-1232.

3 Cherkaoui A， Hibbs J， Emonet S， et al. Comparison of two matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry methods with conventional phenotypic identification for routine identification of bacteria to the species level. J Clin Microbiol， 2010，48:1169-1175.

4 Wunschel SC， Jarman KH， Petersen CE， et al. Bacterial analysis by MALDI-TOF mass spectrometry: an inter-laboratory comparison. J Am Soc Mass Spectrom， 2005， 16:456-462.

5 Fetsch PA， Simone NL， Bryant-Greenwood PK， et al. Proteomic evaluation of archival cytologic material using SELDI affinity mass spectrometry: potential for diagnostic applications. Am J Clin Pathol，2002，118:870-876.

6 Camara JE， Hays FA. Discrimination between wild-type and ampicillin-resistant Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. AnalBioanal Chem， 2007，389:1633-1638.

7 Conway GC， Smole SC， Sarracino DA， et al. Phyloproteomics: species identification of Enterobacteriaceae using matrix-assistedlaser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. J Mol Microbiol Biotechnol， 2001，3:103-112.

8 鮑春梅，陳素明，崔恩博，等.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜快速鑒定革蘭陰性桿菌的研究.實用檢驗醫(yī)師雜志，2012，4: 96-99.

(本文編輯:李銀平)

The application of MALDI-TOF MS in the clinical microbiology detection

YAN Ping , WANG Ping , WANG Xu-hui. Department of Clinical Laboratory, People's Hospital of Changji Hui Autonomous Prefecture, Changji Hui Autonomous Prefecture 831100, Xinjiang , China

ObjectiveTo explore the application value of the matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometer (MALDI-TOF MS) in rapid detection of clinical microbiology .Methods525 isolation strains were collected in People's Hospital of Changji Hui Autonomous Prefecture in the past two years, that were isolated from sputum, urine, blood, secretions and pus in clinical specimens respectively, Among them , 225 strains of gram negative bacteria, 225 strains of gram positive bacteria, 75 strains of yeast . The MALDI-TOF MS identification results and VITEK2 Compact identification results were compared .ResultsThe compliance rate of MALDI-TOF MS and VITEK2 Compact, gram negative bacteria was 96.4% (217/225), gram positive bacteria was 94.2% (212/225) , yeast was 94.7% (71/75) .ConclusionsMALDI-TOF MS technology is rapid, simple, accurate and the price is low, it will have broad prospect of application in rapid identification of clinical common pathogenic bacteria especially in rapid detection of critically ill patients, and took precious time for clinical treatment . However, the application of this technology still has some limitations, it's accuracy was affected by the purity of tested bacteria and the ability in experimental operation , and has a low accuracy for some species, the process of detection is more complex for virus［1］, therefore MALDI-TOF MS technology still need a further study .

Microbiology . matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometer . Rapid detection

新疆昌吉回族自治州科技開發(fā)計劃項目(2016S08-01)

831100 新疆維吾爾自治區(qū)昌吉回族自治州，昌吉回族自治州人民醫(yī)院檢驗科

閻萍，Email:1505159331@qq.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2016.04.001

2016-11-07)