溫和灸皮膚神經(jīng)性TRPV1啟動(dòng)機(jī)制及對(duì)內(nèi)臟痛的效應(yīng)機(jī)制研究

鄭桂芝 李 晗 吳煥淦， 馬曉芃 方臻臻 馬 喆 周次利 施 征 劉慧榮，

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海，200437； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海，200030)

溫和灸皮膚神經(jīng)性TRPV1啟動(dòng)機(jī)制及對(duì)內(nèi)臟痛的效應(yīng)機(jī)制研究

鄭桂芝1李 晗1吳煥淦1，2馬曉芃2方臻臻1馬 喆1周次利2施 征2劉慧榮1，2

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海，200437； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海，200030)

目的：圍繞體表神經(jīng)性瞬時(shí)電位感受器香草酸亞型1(Neuronal Transient Receptor Potential Vanilloid 1，nTRPV1)研究溫和灸皮膚啟動(dòng)機(jī)制和對(duì)內(nèi)臟痛模型的鎮(zhèn)痛效果。方法：野生型C57BL/6小鼠作為主要研究對(duì)象。于8周齡時(shí)予130 μg/mL硝基苯磺酸灌腸(Three Nitrobenzene Sulfonic Acid，TNBS)誘導(dǎo)慢性內(nèi)臟痛模型小鼠。12周齡時(shí)，溫和灸組(Moxibustion，Mox)和假溫和灸組(Sham Mox)的小鼠足三里穴區(qū)接受溫和灸刺激，Mox的穴區(qū)皮膚溫度控制在(45±1)℃，而Sham Mox控制在(37±1)℃。借用腹部撤回反射評(píng)分(Abdominal Withdrawal Reflex，AWR)作為疼痛主要觀察指標(biāo)。使用神經(jīng)纖維素蛋白(Protein Gene Product 9.5，PGP9.5)和TRPV1免疫熒光雙標(biāo)，觀察艾灸對(duì)于nTRPV1的影響。同時(shí)使用TRPV1阻斷劑——辣椒平(Capsazepine，CPZ)，分別以高、低劑量阻斷體表TRPV1，觀察Mox的鎮(zhèn)痛和體表nTRPV1的表達(dá)。另外，又分別使用坐骨神經(jīng)結(jié)扎和樹(shù)脂毒素(Resiniferatoxin，RTX)阻斷皮下nTRPV1，研究Mox的鎮(zhèn)痛和體表nTRPV1表達(dá)。結(jié)果：相對(duì)于Sham Mox，Mox顯著改善了內(nèi)臟痛模型小鼠的AWR評(píng)分(P<0.05)和促進(jìn)nTRPV1的表達(dá)量增加。使用CPZ阻斷后，Mox未能引起AWR的改善，但低劑量的CPZ無(wú)法抑制Mox引起的nTRPV1的增多。而使用nTRPV1阻斷方式后，發(fā)現(xiàn)體表的nTRPV1顯著減少。Mox不能有效的發(fā)揮鎮(zhèn)痛效果，而且不能促進(jìn)nTRPV1的增多。結(jié)論：溫和灸可能通過(guò)影響體表nTRPV1的方式，對(duì)內(nèi)臟痛模型發(fā)揮相應(yīng)的鎮(zhèn)痛效果，阻斷nTRPV1之后，溫和灸鎮(zhèn)痛效果消失。

溫和灸；內(nèi)臟痛；體表神經(jīng)性TRPV1；鎮(zhèn)痛；皮膚啟動(dòng)機(jī)制

慢性內(nèi)臟疼痛是炎癥性腸病和腸易激綜合征患者的臨床常見(jiàn)癥狀。與軀體痛研究相比，內(nèi)臟痛覺(jué)的研究還處于初級(jí)階段，各方面機(jī)制尚不明確[1]。針對(duì)內(nèi)臟痛的治療，全世界學(xué)者嘗試探索各種方式來(lái)治療此病，我們課題組前期研究證明了艾灸對(duì)內(nèi)臟痛存在調(diào)整作用[1-2]。

一般認(rèn)為，艾灸通過(guò)刺激體表相應(yīng)腧穴，通過(guò)一系列的神經(jīng)、血液等通路，對(duì)相應(yīng)靶器官發(fā)揮調(diào)整。所以，艾灸通過(guò)影響腧穴位置皮膚組織，進(jìn)而將此刺激信號(hào)傳入體內(nèi)，是艾灸發(fā)揮作用的首要途徑[5]。圍繞艾灸對(duì)皮膚如何產(chǎn)生影響，產(chǎn)生何種影響的研究，稱之為艾灸皮膚啟動(dòng)機(jī)制。

人體體表的瞬時(shí)感受器電位家族(Transient Receptor Potential，TRP)主要扮演著感受外界的不同溫度的角色，研究發(fā)現(xiàn)TRP受體不同亞型可被不同溫度激活，如TRPV1≥43 ℃，TRPV2≥52 ℃，TRPV3≥33 ℃，TRPV4≥27 ℃。巧合的是，朱璉在1954年提出溫和灸時(shí)，就強(qiáng)調(diào)溫和灸對(duì)機(jī)體的刺激溫度為42～43 ℃[3]。結(jié)合TRPV1特異性的激活溫度，學(xué)術(shù)界開(kāi)展很多圍繞溫和灸和體表TRPV1的研究[4-6]，發(fā)現(xiàn)艾灸激活TRPV1后，對(duì)靶器官存在良性調(diào)整作用，而阻斷體表的TRPV1后作用消失[7]。

體表TRPV1主要分成神經(jīng)性TRPV1(Neuronal TRPV1，nTRPV1)和非神經(jīng)性TRPV1(Non Neuronal TRPV1，nnTRPV1)[8]。研究認(rèn)為nTRPV1被激活后，促進(jìn)細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流，可以直接作用于神經(jīng)末梢，引起神經(jīng)電沖動(dòng)，而非non-neuronal trpv1可能更多參與體表各種皮膚疾病的形成[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，使用坐骨神經(jīng)結(jié)扎(Sciatic Nerve Ligation，SNL)和皮下樹(shù)脂毒素(Resiniferatoxin，RTX)注射，可有效抑制nTRPV1的表達(dá)[10]。

本研究假設(shè)溫和灸刺激皮膚足三里穴區(qū)激活nTRPV1，進(jìn)而對(duì)內(nèi)臟痛模型小鼠發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7周齡野生型C57BL/6小鼠(購(gòu)于上海斯萊科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(溫度21±1 ℃，濕度50%～70%，12 on/12 off光照循環(huán))。小鼠購(gòu)入后置于動(dòng)物房適應(yīng)環(huán)境1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器 清艾條(0.5 cm×10 cm，南陽(yáng)艾條廠)、三硝基苯磺酸(Three nitrobenzene sulfonic acid，TNBS，美國(guó)Sigma公司)、戊巴比妥鈉(德國(guó)Merck公司)、神經(jīng)纖維絲蛋白抗體(Protein gene product 9.5，PGP9.5，美國(guó)Abcam公司)、TRPV1抗體(美國(guó)Abcam公司)、辣椒平(Capsazepine，CAP，加拿大J&K公司)、吐溫-80(美國(guó)Sigma公司)、RTX(上海江萊生物科技有限公司)、紅外熱成像儀(日本NEC公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)一共分成3個(gè)部分：實(shí)驗(yàn)一研究艾灸體表溫度控制在(45±1)℃和(37±1)℃溫和灸鎮(zhèn)痛效果；實(shí)驗(yàn)二使用高、低兩個(gè)劑量的CPZ干預(yù)后，觀察(45±1)℃溫和灸鎮(zhèn)痛效果；實(shí)驗(yàn)三使用SNL和RTX干預(yù)后，觀察(45±1)℃溫和灸鎮(zhèn)痛效果。

實(shí)驗(yàn)一：一共分成4組，即空白組(Control)、模型組(Model)、(45±1)℃溫和灸組(Mox)和(37±1)℃溫和灸組(Sham Mox)。

實(shí)驗(yàn)二：一共分成5組，即Model組、Mox組、低劑量CPZ(LCPZ)組、LCPZ+Mox組、高劑量CPZ(HCPZ)組、HCPZ+Mox組。

實(shí)驗(yàn)三：一共分成5組，即Model組、Mox組、RTX組、RTX+Mox組、SNL組、SNL+Mox組。

1.4 模型制備 造模藥物配置方案：130 μgTNBS：5%的TNBS原液0.1 mL與30%乙醇38.5 mL混合。

于小鼠8周齡開(kāi)始造模，實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食12 h。使用0.5%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射后，小鼠完全麻醉后，使用嬰兒棉簽蘸取少量液體石蠟以潤(rùn)滑、擴(kuò)張腸道，抽取0.1 mL配置好的TNBS，使用小鼠灌胃針經(jīng)肛門(mén)插入3 cm，緩慢注入TNBS藥物(如果有藥物溢出，重新吸取益處藥物，再次緩慢注入)，小鼠于注藥后，倒置10 min，防止藥物溢出[11]。小鼠造模4周，于12周齡時(shí)開(kāi)始艾灸干預(yù)。

1.5 艾灸干預(yù) 待小鼠12周齡時(shí)，將清醒狀態(tài)的小鼠固定于特殊固定器，使用紅外熱成像儀測(cè)溫，將測(cè)溫點(diǎn)定位于小鼠雙腿足三里穴區(qū)。點(diǎn)燃艾條后，對(duì)準(zhǔn)足三里穴區(qū)行溫和灸。10 min/d，連續(xù)7 d。見(jiàn)圖1。其中Mox組的測(cè)溫點(diǎn)溫度控制在(45±1)℃，Sham Mox組的測(cè)溫點(diǎn)溫度控制在(37±1)℃，整個(gè)測(cè)溫過(guò)程中，根據(jù)紅外熱像成像儀特有屬性(溫度不同、色帶不同)，以保證足三里穴區(qū)的溫度，是小鼠體表溫度最高點(diǎn)。

1.6 辣椒平注射 本實(shí)驗(yàn)使用50%的二甲亞礬生理鹽水溶液作為有效溶劑，配置0.4 mg/mL和4 mg/mL的不同劑量的CPZ藥物，每次溫和灸干預(yù)前30 min給予穴區(qū)注射，單次注射100 μL的量[12-13]。

1.7 坐骨神經(jīng)結(jié)扎 于10周齡入組小鼠進(jìn)行雙下肢坐骨神經(jīng)選擇性結(jié)扎，用0.5%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，下肢剃毛，碘伏消毒，暴露腘窩坐骨神經(jīng)，用7-0尼龍線進(jìn)行結(jié)扎坐骨神經(jīng)，逐層縫合肌肉皮膚，小鼠臀部注射20萬(wàn)U的青霉素以防止感染，每天給予傷口碘酒消毒[14]。

1.8 樹(shù)脂毒素注射 RTX溶于96%無(wú)水乙醇的溶液，濃度為3 μg/mL、7 μg/mL、10 μg/mL。小鼠給藥劑量為30、70、100 μg/kg皮下注射，皮下連續(xù)注射3 d。對(duì)于10周齡入組小鼠，用0.5%戊巴比妥鈉麻醉，下肢剃毛，再用50 μL注射器，1 μL/g/只劑量從低濃度到高濃度連續(xù)注射3 d RTX溶液[14]。

1.9 腹部撤回反射評(píng)分 小鼠內(nèi)臟痛的評(píng)估方式，采用腹部撤回反射評(píng)分(Abdominal Withdrawal Reflex，AWR)，于艾灸前1 d和艾灸結(jié)束后1 d進(jìn)行評(píng)分。見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

注：整個(gè)治療周期一共9 d，第1、9天行AWR評(píng)估，第2～8天進(jìn)行艾灸干預(yù)。

在清醒狀態(tài)下，用布袋包裹小鼠上半身，用嬰兒棉簽蘸取少量液體石蠟，以潤(rùn)滑、擴(kuò)張小鼠直腸，插入特制氣囊。使用醫(yī)用膠布包裹送氣管道和鼠尾，并置于金屬網(wǎng)格平面上，用8 cm×3 cm×4 cm的透明長(zhǎng)方體作為密閉器固定住小鼠。小鼠于插入氣囊后靜置30 min后，用血壓計(jì)連接三通管，用5 mL注射器向氣囊注入空氣，行直腸擴(kuò)張，判定AWR評(píng)分。

分別給于15 mmHg、30 mmHg、45 mmHg、60 mmHg 4個(gè)不同壓力等級(jí)的結(jié)直腸擴(kuò)張刺激。單次擴(kuò)張時(shí)間20 s，間隔30 s，4個(gè)梯度擴(kuò)張完成后，小鼠休息5 min進(jìn)行下一輪不同等級(jí)的直腸擴(kuò)張，一共重復(fù)3次，取3次平均值作為最終評(píng)分值。

1.10 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 將4%多聚甲醛溶液固定的實(shí)驗(yàn)一的小鼠結(jié)腸樣本，經(jīng)脫水、透明、透蠟，石蠟包埋，常規(guī)切片后進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化，以判斷造模對(duì)腸道組織的影響。

1.11 皮膚組織免疫熒光觀察 為了研究nTRPV1，使用PGP9.5特異性的標(biāo)記皮膚神經(jīng)末梢纖維組織，與TRPV1進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)，雙標(biāo)區(qū)域即為nTRPV1的所在位置。小鼠處死后，摘取足三里穴區(qū)皮膚組織，直接液氮快速冷凍，皮膚凍存于-80 ℃冰箱。采用石蠟切片的方式，制成皮膚切片。經(jīng)烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、一抗孵育、二抗孵育、封片和拍照。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)描述。AWR分析使用單因素方差分析，當(dāng)方差齊性時(shí)，使用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett′s T3檢驗(yàn)。SPSS 20.0(IBM，US)為主要統(tǒng)計(jì)軟件，當(dāng)P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸道組織的病理學(xué)觀察 8周齡小鼠接受TNBS造模，待12周后，予溫和灸干預(yù)，發(fā)現(xiàn)Model和Control均表現(xiàn)為正常的腸道組織，腺體結(jié)構(gòu)完整、無(wú)炎性物質(zhì)滲出、無(wú)膿腫、無(wú)炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí)Mox和Sham Mox存在相同的表現(xiàn)。見(jiàn)圖2。說(shuō)明TNBS成功誘導(dǎo)腸道炎性反應(yīng)后誘發(fā)的內(nèi)臟痛模型，腸道組織無(wú)黏膜損傷。

圖2 腸道組織病理切片

注：Control：空白組；Model：模型組；Mox：溫度控制在(45±1)℃的溫和灸；Sham Mox：溫度控制在(37±1)℃的溫和灸。

2.2 Mox和Sham Mox對(duì)內(nèi)臟痛及皮下nTRPV1的影響 TNBS誘導(dǎo)的慢性內(nèi)臟痛小鼠，Model組的AWR比Control組明顯增高(P<0.05)。同時(shí)，使用Mox和Sham Mox干預(yù)后，小鼠AWR評(píng)分顯著下降，其中Mox組對(duì)AWR的改善更明顯。見(jiàn)圖3。突出了Mox對(duì)內(nèi)臟痛的改善效果。對(duì)各組足三里穴區(qū)皮膚nTRPV1進(jìn)行免疫熒光分析，Mox組明顯增多了nTRPV的表達(dá)，而Sham Mox卻沒(méi)有增多。見(jiàn)圖4。說(shuō)明超過(guò)TRPV1激活溫度的刺激后，可以促進(jìn)nTRPV1的表達(dá)。

2.3 高、低濃度CPZ阻斷后，Mox對(duì)內(nèi)臟痛和皮下nTRPV1的影響 使用高、低不同濃度的CPZ干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)Mox不能改善小鼠AWR評(píng)分，說(shuō)明在阻斷體表TRPV1之后，Mox對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛效果消失，提示Mox可能通過(guò)激活TRPV1后抑制內(nèi)臟痛。見(jiàn)圖5。值得注意的是，nTRPV1免疫熒光分析，LCPZ+Mox依然可以促進(jìn)nTRPV1的表達(dá)，但是HCPZ+Mox的nTRPV1沒(méi)有變化。說(shuō)明低濃度CPZ尚不能抑制Mox對(duì)nTRPV1的影響。見(jiàn)圖6。

圖3 實(shí)驗(yàn)一AWR評(píng)分

注：Control：空白組；Model：模型組；Mox：溫度控制在(45±1)℃的溫和灸；Sham Mox：溫度控制在(37±1)℃的溫和灸。#：P<0.05、##：P<0.01 v.s.Control；*：P<0.05、**：P<0.01 v.s.Model。

圖4 實(shí)驗(yàn)一皮膚免疫熒光

注：Control：空白組；Model：模型組；Mox：溫度控制在(45±1)℃的溫和灸；Sham Mox：溫度控制在(37±1)℃的溫和灸。

圖5 實(shí)驗(yàn)二AWR評(píng)分

注：Model：模型組；Mox：溫度控制在(45±1)℃的溫和灸；LCPZ：0.4 mg/mL辣椒平；HCPZ：4 mg/mL辣椒平。

2.4 SNI和RTX干預(yù)后，Mox對(duì)內(nèi)臟痛和皮下nTRPV1的影響 使用SNI和RTX干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)Mox亦不能改善內(nèi)臟痛模型的疼痛水平。見(jiàn)圖7。SNI和RTX均可以明顯抑制nTRPV1的表達(dá)，而且Mox不能促進(jìn)其表達(dá)。見(jiàn)圖8。說(shuō)明在SNI和RTX抑制了皮下nTRPV1的表達(dá)，Mox不能發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。而且Mox也不能促進(jìn)nTRPV1的表達(dá)，提示Mox可能通過(guò)激活nTRPV1，進(jìn)而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效果。

圖6 實(shí)驗(yàn)二皮膚免疫熒光

注：Model：模型組；Mox：溫度控制在(45±1)℃的溫和灸；LCPZ：0.4 mg/mL辣椒平；HCPZ：4 mg/mL辣椒平。

圖7 實(shí)驗(yàn)三AWR評(píng)分

注：Model：模型組；Mox：溫度控制在(45±1)℃的溫和灸；RTX：樹(shù)脂毒素；SNL：坐骨神經(jīng)結(jié)扎。

3 討論

本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Mox可以有效對(duì)內(nèi)臟痛模型小鼠發(fā)揮鎮(zhèn)痛效果，內(nèi)臟痛評(píng)分AWR值明顯降低，同時(shí)可以促進(jìn)皮下nTRPV1的表達(dá)。使用CPZ阻斷皮膚TRPV1，發(fā)現(xiàn)Mox不能發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，同時(shí)CPZ有效的阻斷了Mox引起的nTRPV1的增多。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)體表TRPV1分成nTRPV1和nnTRPV1，通過(guò)上述研究發(fā)現(xiàn)nTRPV1在Mox皮膚啟動(dòng)機(jī)制中扮演更重要的作用，Mox通過(guò)刺激神經(jīng)末梢的nTRPV1，激發(fā)神經(jīng)電緊張，影響神經(jīng)中樞，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。所以采用特異性阻斷nTRPV1的方式——SNI和RTX，雙重觀察Mox對(duì)nTRPV1的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mox沒(méi)有鎮(zhèn)痛效果且nTRPV1并未增多。

圖8 實(shí)驗(yàn)三皮膚免疫熒光

注：Model：模型組；Mox：溫度控制在(45±1)℃的溫和灸；RTX：樹(shù)脂毒素；SNL：坐骨神經(jīng)結(jié)扎。

過(guò)去學(xué)術(shù)界使用TRPV1激動(dòng)劑，觀察TRPV1激活之后，對(duì)疼痛的調(diào)整效果[15-16]。TRPV1激活之后，鈣離子大量?jī)?nèi)流，引起一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路激活，細(xì)胞膜滲透壓增高，囊內(nèi)TRPV1激活，線粒體腫脹，進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞感覺(jué)功能喪失和脫敏[17]。故認(rèn)為大于43 ℃溫和灸也可能通過(guò)此機(jī)制調(diào)整內(nèi)臟痛，此溫度是TRPV1特有的激活溫度。在本項(xiàng)研究中，我們使用紅外熱像儀將溫度控制在(45±1)℃的溫和灸為主要干預(yù)手段，(37±1)℃溫和灸作為對(duì)照，以突出激活TRPV1后特有的鎮(zhèn)痛表現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mox確實(shí)存在鎮(zhèn)痛效果。

過(guò)去圍繞艾灸皮膚啟動(dòng)機(jī)制的研究，都認(rèn)為艾灸后可以引起體表TRPV1的增多。王玲玲等用溫和灸對(duì)高脂血癥的調(diào)整效果，比較了38 ℃和45 ℃的溫和灸，發(fā)現(xiàn)45 ℃在降低三酰甘油和膽固醇方面優(yōu)于38 ℃灸，從而可以降低動(dòng)脈粥樣硬化形成的風(fēng)險(xiǎn)，并發(fā)現(xiàn)45 ℃可以促進(jìn)TRPV1的表達(dá)含量增高[18]，在此基礎(chǔ)上使用CPZ可以有效阻斷艾灸引起的降脂效果[19]。張承瞬在軀體疼痛模型上也發(fā)現(xiàn)了艾灸對(duì)TRPV1的促進(jìn)作用，認(rèn)為艾灸通過(guò)激活TRPV1，而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[20]。所以在我們的研究中使用CPZ阻斷體表TRPV1，發(fā)現(xiàn)艾灸的鎮(zhèn)痛效果消失。

結(jié)合已有的研究結(jié)果，我們認(rèn)為可能艾灸的穴區(qū)啟動(dòng)機(jī)制和nTRPV1聯(lián)系更為緊密，通過(guò)激活nTRPV1，直接可以影響神經(jīng)中樞。所以我們?cè)趯?shí)驗(yàn)二的基礎(chǔ)上又設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)三。研究發(fā)現(xiàn)，特異性的阻斷nTRPV1后，Mox的鎮(zhèn)痛效果消失。同時(shí)Mox可引起nTRPV1增多，Sham Mox沒(méi)有促進(jìn)其表達(dá)。使用CPZ阻斷TRPV1，Mox鎮(zhèn)痛效果消失，但是LCPZ+Mox依然促進(jìn)了nTRPV1的增多，可能CPZ的濃度太低，無(wú)法抑制Mox促進(jìn)nTRPV1的表達(dá)。針對(duì)nTRPV1，使用特異性的阻斷方式，均發(fā)現(xiàn)降低了nTRPV1的表達(dá)，而且Mox不能促進(jìn)其表達(dá)。

本項(xiàng)研究初步探索了艾灸和nTRPV1的關(guān)系，認(rèn)為可能艾灸通過(guò)激活nTRPV1，影響中樞系統(tǒng)，調(diào)整內(nèi)臟疼痛。但是依然存在一些問(wèn)題需要改進(jìn)。首先針對(duì)和腸道內(nèi)臟痛聯(lián)系較為緊密的低位中樞，我們今后將納入更多的觀察指標(biāo)，證明Mox鎮(zhèn)痛分子機(jī)制。其次，現(xiàn)有的檢測(cè)nTRPV1的手段，可以采用同位素特異性的標(biāo)記進(jìn)行定量分析，但是本課題組缺乏開(kāi)展同位素研究資質(zhì)，且相關(guān)單位也不提供技術(shù)支持，導(dǎo)致只能使用免疫熒光的方式，標(biāo)記nTRPV1做定性分析[21]。最后，艾灸通過(guò)激活nTRPV1，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其具體通路如何，需要深入的探索。

綜上所述，本項(xiàng)研究初步探明超過(guò)TRPV1激活溫度的溫和灸，促進(jìn)皮下nTRPV1的表達(dá)，對(duì)內(nèi)臟痛模型小鼠發(fā)揮有效的鎮(zhèn)痛作用。然而，當(dāng)TRPV1阻斷或是nTRPV1抑制后，溫和灸的鎮(zhèn)痛效果被明顯抑制。說(shuō)明溫和灸通過(guò)激活nTRPV1的方式，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)內(nèi)臟痛發(fā)生調(diào)整效果。

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(2016-12-07收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Effect of Warm Moxibustion on Cutaneous Neuronal TRPV1 and Visceral Pain

Zheng Guizhi1，Li Han1，Wu Huangan2，Ma Xiaopeng1, Fang Zhenzhen1，Ma Zhe1，Zhou Cili2，Shi Zheng2,Liu Huirong1

(1YueyangHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 2ShanghaiResearchInstituteofAcupunctureandMeridian,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200030,China)

Objective:To study the relationship between the cutaneous starting mechanism and the analgesia effect of warm moxibustion on visceral pain by the cutaneous neuronal transient receptor potential vanilloid 1 (nTRPV1). Methods:SPF wild type C57BL/6 mouse were involved in this study. At the week 8, the visceral pain was modeled by 130 μg/mL TNBS injected into the colon in SPF C57BL/6 wild type mice. During the week 12, mice in the Mox group and Sham Mox group received warm moxibustion on ST-36. The cutaneous temperature was controlled around (45±1)℃ in the Mox group while (37±1)℃ in the Sham Mox group. The analgesia effect of moxibustion was assessed by Abdominal withdrawal reflex (AWR). And nTRPV1 in the cutaneous were observed by immunofluorescence which was marked with protein gene product 9.5 (PGP9.5) and TRPV1. Low and high volume capsazepine (CPZ) inhibiting cutaneous TRPV1 activity were involved to observe the changes of analgesia effect and the nTRPV1 expression. Furthermore, sciatic nerve ligation (SNL) and resiniferatoxin (RTX) inhibiting nTRPV1 activity were used to study the differences of analgesia and nTRPV1 expression respectively. Results:Comparing with Sham Mox, Mox significantly reduced the AWR score in the visceral pain mice (P<0.05), and increased the expressions of nTRPV1. After CPZ being involved, the analgesia effect of Mox was inhibited, but low volume CPZ was not able to inhibit the promotion of nTRPV1 by moxibustion. Both SNI and RTX involved were able to inhibit the analgesia and the nTRPV1 of moxibustion. Conclusion:Warm moxibustion is able to improve the pain level of visceral pain which may be mediated by the cutaneous nTRPV1. After blocked the TRPV1 in the skin, the analgesia of warm moxibustion disappeared.

Warm moxibustion; Visceral pain; Cutaneous neuronal TRPV1; Analgesia; The starting mechanism of the skin

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(“973”計(jì)劃)項(xiàng)目(編號(hào)：2015CB554501；2009CB522900)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81574081)；上海市重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(編號(hào)：S30304-A9、S30304-A13)

吳煥淦(1956—)，男,漢族，浙江仙居人，上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，首席教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事針灸作用的臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail：wuhuangan@126.com；劉慧榮(1976—)，女，河北省容城縣人，漢族，2004年上海中醫(yī)藥大學(xué)畢業(yè)，博士研究生導(dǎo)師，研究員，主要從事針灸治療胃腸疾病的臨床和基礎(chǔ)研究

R245

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.002