法醫(yī)硅藻檢驗(yàn)關(guān)鍵技術(shù)及設(shè)備研發(fā)*

廣東省公安廳科技信息化處科技管理科

（廣東省公安廳，廣東 廣州510050）

法醫(yī)硅藻檢驗(yàn)關(guān)鍵技術(shù)及設(shè)備研發(fā)*

廣東省公安廳科技信息化處科技管理科

（廣東省公安廳，廣東 廣州510050）

1　項(xiàng)目基本情況

水中腐敗尸體的死因鑒定是世界公認(rèn)的法醫(yī)學(xué)難題，在公安部重點(diǎn)研究計(jì)劃項(xiàng)目資助下，課題組開展法醫(yī)硅藻檢驗(yàn)關(guān)鍵技術(shù)和設(shè)備研發(fā)，并取得重大突破：建立了微波消解新方法，該方法高效、環(huán)保，硅藻回收率高；建立了真空抽濾富集硅藻方法，發(fā)明了自動化多聯(lián)真空抽濾設(shè)備，避免了硅藻損失；建立了掃描電鏡觀察新方法，種屬鑒定準(zhǔn)確，避免了硅藻漏檢、誤檢；研發(fā)了膜透明-光鏡聯(lián)用法，解決了硅藻檢驗(yàn)技術(shù)在基層難以推廣的難題；研究了硅藻臟器分布，規(guī)范了檢材提?。唤⑷珖饕蚬柙宸植紨?shù)據(jù)庫，編著了《法醫(yī)硅藻學(xué)掃描電鏡圖譜》，解決了法醫(yī)學(xué)工作者難以鑒定硅藻種屬的難題；制定了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范了硅藻檢驗(yàn)操作程序，避免假陽性和假陰性，使硅藻檢驗(yàn)備受爭議的問題得到解決；已獲國家專利5項(xiàng)、發(fā)表文章43篇（SCI/EI收錄15篇）、專著1部；培養(yǎng)博士、碩士6名。

2　項(xiàng)目實(shí)施背景

水中尸體是法醫(yī)學(xué)尸體檢驗(yàn)中最常見的類型之一。據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《全球溺死報(bào)告》，每年全世界有37.2萬人溺死，平均每小時(shí)42人溺死，2012年僅中國就有約6萬人溺死。水中尸體死因鑒定是法醫(yī)學(xué)必須解決的首要問題，也是案件定性的關(guān)鍵。對于新鮮的水中尸體，可通過口鼻部蕈樣泡沫、水性肺氣腫、呼吸道內(nèi)泥沙等溺死的典型征象進(jìn)行溺死鑒定。然而80%以上的水中尸體被發(fā)現(xiàn)時(shí)呈高度腐敗，各種溺死征象不復(fù)存在，且尸體解剖及組織學(xué)檢驗(yàn)無與溺死相關(guān)的特異性病理學(xué)改變，其死因鑒定成為世界公認(rèn)的難題。由于死因不明、案件無法定性，極易導(dǎo)致家屬不滿、媒體炒作，引發(fā)群體性事件，如美國“2013· 2·19藍(lán)可兒事件”等。水中腐敗尸體的死因鑒定成為急需解決的重大難題。

為了解決上述難題，法醫(yī)學(xué)工作者先后研究了硅藻檢驗(yàn)、血液生化檢驗(yàn)、異物元素檢驗(yàn)、植物花粉孢子檢驗(yàn)、葉綠素a檢驗(yàn)等方法，然而除硅藻檢驗(yàn)外，其他方法僅限于實(shí)驗(yàn)研究，未能在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中應(yīng)用。硅藻廣泛生活于各類水體，種類有16000多種，大小在1μm～200μm之間；硅藻對水質(zhì)敏感，水環(huán)境不同，硅藻群落亦有差異；硅藻細(xì)胞壁高度硅質(zhì)化，即使?jié)饬蛩?、濃硝酸煮沸也難以破壞其紋理特征。由于生前入水者的主動呼吸，硅藻可隨溺液吸入肺泡，進(jìn)入血液循環(huán)，分布到各組織器官；通過對臟器組織和水中的硅藻進(jìn)行定性定量分析與比對，不僅可直接判斷死因，而且有助于推斷溺死地點(diǎn)。因此，如何從水中尸體組織器官，尤其體循環(huán)臟器中檢出硅藻并準(zhǔn)確鑒定其種屬成為國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。

自1904年Revenstorf從肺切面液體中首次觀察到硅藻后，一個(gè)多世紀(jì)以來，產(chǎn)生了許多種硅藻檢驗(yàn)方法，但這些方法的差異主要體現(xiàn)在有機(jī)質(zhì)消解方面，消解方法包括強(qiáng)酸消解法、酶消解法、組織溶解劑法、硅膠梯度法、微波消解法等。盡管硅藻檢驗(yàn)有一百多年歷史，國內(nèi)外硅藻檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室一直采用的強(qiáng)酸消解、離心富集、光鏡觀察技術(shù)并沒有突破，存在顯著缺陷。表現(xiàn)在：（1）缺乏行之有效的取材及檢驗(yàn)規(guī)范，取材隨意、送檢及檢驗(yàn)開放、步驟繁瑣、容易污染，產(chǎn)生假陽性。（2）由于消解不徹底、反復(fù)離心損失等導(dǎo)致溺死尸體檢出率低；對于硅藻含量少的體循環(huán)臟器，極易得到假陰性的結(jié)果。（3）溺死尸體肝、腎、骨髓等臟器組織中的硅藻一般個(gè)體小，含量低，受放大倍數(shù)所限，采用光鏡檢測時(shí)，因個(gè)體小、紋理特征難以辨識，這些微型硅藻易被忽略或其種屬不能被準(zhǔn)確鑒定；另一方面，又可能將其他異物誤認(rèn)為硅藻，因此極易導(dǎo)致漏檢、誤檢的發(fā)生。（4）對環(huán)境及人體有害、勞動強(qiáng)度大。上述缺陷是導(dǎo)致硅藻檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生質(zhì)疑、難以推廣應(yīng)用的主要原因。國內(nèi)僅有屈指可數(shù)的實(shí)驗(yàn)室開展硅藻檢驗(yàn)，且多數(shù)情況下只做肺臟的檢驗(yàn)?？梢?，針對硅藻檢驗(yàn)上述的三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，整體研發(fā)防污染、靈敏、高效、環(huán)保的硅藻檢驗(yàn)技術(shù)及設(shè)備，十分迫切。

3　項(xiàng)目主要內(nèi)容

3.1首次規(guī)范了硅藻檢材提取方法

傳統(tǒng)的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)研究多集中于有機(jī)質(zhì)消解，很少有學(xué)者關(guān)注硅藻檢驗(yàn)檢材提取部位的研究。課題組在對62只新西蘭大白兔、32頭五指山豬溺死臟器硅藻分布研究的基礎(chǔ)上，以30具不同水體典型溺死尸體作為研究對象，對肺、肝、腎、脾、心血、股骨骨髓的硅藻分布進(jìn)行了系統(tǒng)研究，明確了相關(guān)臟器取材部位、規(guī)范提取送檢程序，相關(guān)內(nèi)容編入行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及本科教材。

3.2首次建立了微波消解提取硅藻新方法

通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，首次建立了采用濃硝酸-過氧化氫密閉式微波消解體系以及梯度微波消解程序的硅藻提取新方法，該方法消解時(shí)間僅需20min，有機(jī)質(zhì)消解完全，硅藻外殼結(jié)構(gòu)特征完整，消解過程密閉，可有效防止假陽性、有害氣體對環(huán)境和人體的損害。該方法已獲國家發(fā)明專利，論文在《Forensic Science International》、《中國法醫(yī)學(xué)雜志》等刊物發(fā)表。

3.3首次建立了膜過濾富集硅藻方法

目前國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室均采用離心方法富集硅藻，采用2500～4000rpm離心15～25min，重復(fù)上述步驟3～5次直至上清液酸堿度達(dá)到6.5～7.5。課題組研究發(fā)現(xiàn)離心導(dǎo)致了大量硅藻的損失，例如4000r/min離心15min一次硅藻損失在29.94%至49.60%（34.18±9.19%）之間，其中最長徑小于40μm的硅藻占到了90%以上，而這些硅藻恰是體循環(huán)臟器的主要類型。離心損失是導(dǎo)致溺死尸體體循環(huán)臟器硅藻檢驗(yàn)陽性率低的主要原因。為避免離心所致的硅藻損失，課題組發(fā)明了一種基于膜過濾的硅藻富集方法，該方法已獲國家發(fā)明專利，研究論文發(fā)表于《International Journal of Legal Medicine》、《法醫(yī)學(xué)雜志》。

3.4發(fā)明了真空抽濾富集硅藻設(shè)備

由于濾膜孔徑小，濾液在自然重力作用下難以通過濾膜，課題組基于真空抽濾的設(shè)計(jì)思路，先后研發(fā)了單聯(lián)真空抽濾裝置、多聯(lián)真空抽濾裝置，最終發(fā)明了多聯(lián)真空抽濾設(shè)備，并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化。該設(shè)備的關(guān)鍵管路，容器，閥門以及真空泵以及密封元件，采用高強(qiáng)度耐腐蝕元件設(shè)計(jì)，可長期耐受抽濾操作過程中強(qiáng)酸性液體的腐蝕，防止危險(xiǎn)液體的泄漏；采用專利的氣路通道結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，以及微電腦結(jié)合傳感器智能控制，保證多聯(lián)抽濾中6通道的壓力均勻，穩(wěn)定，保證抽濾效果的一致性；專利真空抽吸管路結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，避免因發(fā)生虹吸現(xiàn)象使真空泵受損；采用觸摸屏控制，提供方法編寫平臺，用戶可根據(jù)工作需要自行設(shè)定自動抽濾程序。該設(shè)備已申請專利3項(xiàng)，其中2項(xiàng)已獲授權(quán)。

3.5首次建立了掃描電鏡觀察硅藻新方法

傳統(tǒng)光鏡法檢測硅藻時(shí)，須以人工方式對每個(gè)視場進(jìn)行觀察，且受光鏡景深限制，從一視場移動至下一視場時(shí)，需重新調(diào)焦，檢驗(yàn)效率低。本方法根據(jù)掃描電鏡景深大（是光鏡的數(shù)百倍）、移動視場時(shí)無需重新調(diào)焦的特點(diǎn)，以自動掃描方式拍攝并存儲每個(gè)視場圖像，大大降低了檢驗(yàn)人員的勞動強(qiáng)度，提高了檢驗(yàn)效率。而且，該法避免了光鏡檢測時(shí)受分辨率所限，微型的舟形藻、卵形藻、曲殼藻等硅藻容易被漏檢、或難以根據(jù)其表面紋理鑒定種屬的不足。

3.6發(fā)明了濾膜透明化技術(shù)

我國省部級、省會市實(shí)驗(yàn)室?guī)缀醵寂鋫鋻呙桦婄R，微波消解-真空抽濾-掃描電鏡聯(lián)用法在實(shí)際應(yīng)用中獲得了很好的效果，推廣應(yīng)用前景良好。但我國大多數(shù)縣（區(qū)）級實(shí)驗(yàn)室都未配備掃描電鏡，限制了該方法在基層實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用。為此，課題組經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)明了一種濾膜透明化試劑，濾膜經(jīng)該試劑透明化處理后可在光鏡下觀察，從而解決了真空抽濾與光鏡難以聯(lián)用的難題。采用微波消解-真空抽濾-光鏡聯(lián)用法，可避免離心造成硅藻損失，經(jīng)濟(jì)、實(shí)用，可在基層法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室推廣。該技術(shù)已申請國家發(fā)明專利，研究論文發(fā)表于《南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》。

3.7首次建立了我國主要水域硅藻分布數(shù)據(jù)庫，確定了溺死相關(guān)主要硅藻

溺死尸體臟器中的硅藻分布與溺液中的硅藻分布具有相關(guān)性。通過對水中尸體臟器和水樣中的硅藻種類、數(shù)量進(jìn)行比對分析，不僅可診斷溺死，而且有助于推斷溺死地點(diǎn)。因此，分析不同水體中的硅藻群落，建立硅藻分布數(shù)據(jù)庫，對于溺死診斷和溺死地點(diǎn)推斷均具有重要意義。課題組根據(jù)我國主要河流（包括黃河、長江、珠江及其他河流）的地理位置、流經(jīng)順序和主要湖泊的分布情況，確定了采樣地點(diǎn)，收集了我國主要河流和湖泊水樣3000多份。經(jīng)分析，所有水樣中共檢出27種硅藻（分類至“屬”），拍攝照片2萬多張，出版了《法醫(yī)硅藻學(xué)掃描電鏡圖譜》，該圖譜對同行進(jìn)行硅藻檢測和種屬鑒定，診斷溺死具有重要的應(yīng)用價(jià)值。而且，經(jīng)對我國主要水域硅藻種類和溺死尸體臟器中硅藻種類的比較分析，確定舟形藻、菱形藻、小環(huán)藻、針桿藻、異極藻、橋彎藻等8類為溺死相關(guān)主要硅藻。研究成果發(fā)表于《Australian Journal of Forensic Sciences》等雜志。

4　應(yīng)用程度及成效

該項(xiàng)目在水中尸體尤其是水中高度腐敗尸體的法醫(yī)死因鑒定方面有重大突破，極大地提高了我國法醫(yī)病理鑒定水平，解決了傳統(tǒng)硅藻檢驗(yàn)方法操作繁瑣、檢出率低、易污染、假陽性高、對人體有害、難以推廣的難題。該成果于2012年被列為公安部重點(diǎn)成果推廣項(xiàng)目、2013年被列為公安部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。已應(yīng)用于全國各地600多宗疑難案件，均作出準(zhǔn)確的鑒定，有效地避免了死因無法確定導(dǎo)致錯(cuò)案、上訪及群體事件，為案件的定性及處置發(fā)揮了關(guān)鍵作用，為維護(hù)司法公正和社會穩(wěn)定作出了巨大貢獻(xiàn)，取得了顯著的社會效益。研究成果應(yīng)用于30多家單位，并在國內(nèi)外重要學(xué)術(shù)會議上與各國專家學(xué)者交流，受到國內(nèi)外同行的廣泛認(rèn)可。

*廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所完成的“法醫(yī)硅藻檢驗(yàn)關(guān)鍵技術(shù)及設(shè)備研發(fā)”獲2015年度公安部科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)。