甘露聚糖肽的結構鑒定

沈艷紅, 陳林梟, 張文清, 徐志珍, 宛燕飛, 張　力, 夏　瑋

(1. 華東理工大學上海市功能性材料化學重點實驗室, 上海 200237;2. 成都利爾藥業(yè)有限公司, 成都 610083)

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甘露聚糖肽的結構鑒定

沈艷紅1, 陳林梟1, 張文清1, 徐志珍1, 宛燕飛2, 張力2, 夏瑋1

(1. 華東理工大學上海市功能性材料化學重點實驗室, 上海 200237;2. 成都利爾藥業(yè)有限公司, 成都 610083)

摘要采用離子交換柱層析和凝膠柱層析從甘露聚糖肽原料中分離純化得到4種均一糖肽MT1-A, MT1-B, MT2-A和MT2-B; 通過單糖組成分析、 甲基化分析、 氫核磁共振譜(1H NMR)、 紅外光譜(IR)和氨基酸組成分析等手段對均一糖肽MT1-A, MT1-B和MT2-B的結構進行了鑒定. 結果表明, 3種均一糖肽的單糖組成、 糖殘基的連接方式與MT2-A相同, 但是分子量以及氨基酸總量有所不同. 測定了不同批次甘露聚糖肽原料的1H NMR譜, 以MT2-A的1H NMR譜圖為標準譜, 以異頭氫區(qū)域為鑒定區(qū)域, 通過計算不同批次甘露聚糖肽原料以及其它3種均一糖肽與MT2-A的1H NMR譜的相關系數, 定量評價了不同批次甘露聚糖肽原料與4種均一糖肽的相似程度. 結果表明, 甘露聚糖肽是由糖鏈結構一致、 分子量和氨基酸含量不同的幾種均一糖肽構成的混合物.

關鍵詞甘露聚糖肽; 多糖; 結構

甘露聚糖肽是中國首創(chuàng)的一種新型免疫促進劑, 原名多抗甲素(Polyactin A, PAA)[1], 是由健康人咽喉部分離的α-溶血性鏈球菌33號菌株經深層培養(yǎng)、 發(fā)酵提取而得到的一種糖肽類物質, 臨床上被廣泛用于惡性腫瘤的輔助治療[2～4]、 皮膚疾病[5,6]和呼吸道反復感染[7,8]等領域.

近年來, 對甘露聚糖肽的研究多集中于生物活性、 作用機制及臨床應用等方面[9～12], 對其結構研究較少, 主要成分結構仍不完全明確. 鄒敬源等[13]從多抗甲素中提取了一種川鏈多糖, 并對其結構進行了初步研究. 本課題組[14]從甘露聚糖肽原料(批號: G100102, 091202, 140401, 140501)中分離純化得到4個均一糖肽MT1-A, MT1-B, MT2-A和MT2-B, 并對其中主要成分MT2-A的精細結構進行了研究. 結果表明, MT2-A的多糖部分主鏈由1,6-連接的甘露糖殘基構成, 分支點位于1,2,6-連接的甘露糖殘基的O-2位, 支鏈由1,2-, 1,3-和末端連接的甘露糖殘基構成; 此外, MT2-A中含有16種氨基酸, 氨基酸總量為4.41%. 本文在此基礎上, 通過單糖組成分析、 甲基化分析、 氫核磁共振譜(1H NMR)、 紅外光譜(IR)和氨基酸組成分析等手段對均一糖肽MT1-A, MT1-B和MT2-B的結構進行鑒定, 并測定了4種均一糖肽的免疫活性, 為甘露聚糖肽活性成分的確定、 生物活性與構效關系的研究以及甘露聚糖質量標準的完善提供了理論基礎.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

甘露聚糖肽原料由成都利爾藥業(yè)有限公司提供(批號: G100102, 091202, 140401, 140501); DEAE-纖維素購自Whatman公司; Sephacryl S-300葡聚糖凝膠介質購自國藥集團化學試劑有限公司; 葡聚糖(Mw=12000, 50000, 270000, 670000)購自Fluka公司; 甘露糖、 葡萄糖、 半乳糖醛酸、 半乳糖、 鼠李糖、 木糖和阿拉伯糖等單糖標準品購自上海源聚生物科技有限公司; 其它試劑均為國產分析純.

DD2-400-MR型核磁共振儀(安捷倫科技有限公司); Nicolet Magna-IR550型紅外光譜儀(美國賽默飛世爾科技公司); Agilent 1100型高效液相色譜儀和Agilent 6890/5975型氣相色譜-質譜聯用儀(安捷倫科技有限公司); Biochrom30+型全自動氨基酸分析儀(英國Biochrom公司).

1.2實驗過程

1.2.1甘露聚糖肽的分離純化及分子量測定采用DEAE-纖維素離子交換柱(50 cm×2.6 cm)分離甘露聚糖肽, 分別以水和NaCl溶液(0.1 mol/L)為洗脫液, 流速2 mL/min, 水洗脫部分所得產物命名為MT1, NaCl溶液洗脫部分所得產物命名為MT2.

對MT1和MT2分別采用Sephacryl S-300凝膠層析柱(80 cm×1.6 cm)純化得到4種均一糖肽MT1-A, MT1-B, MT2-A和MT2-B.

采用高效凝膠過濾色譜法測定甘露聚糖肽的分子量及分布[15,16], 以不同分子量的葡聚糖(Mw=12000, 50000, 270000和670000)為標準品. 根據樣品的峰型判斷其純度, 用Agilent GPC軟件計算樣品分子量及其分布.

1.2.2單糖組成分析參照文獻[17,18]方法, 采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化高效液相色譜法測定單糖組成.

1.2.3甲基化分析采用Needs方法[19,20]對多糖樣品進行甲基化, 用IR檢測, 在確認完全甲基化后, 將多糖水解、 還原及乙?；? 進行氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)分析. GC-MS分析條件: HP-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm); 程序升溫: 120 ℃保持2 min, 以5 ℃/min的速率升溫至250 ℃, 保持10 min; 分流比3∶1; 進樣量1 μL, 進樣口溫度250 ℃, 質譜離子源溫度180 ℃; 接口溫度200 ℃, 離子源電壓70 eV.

1.2.4紅外光譜分析取甘露聚糖肽樣品1～2 mg, 用溴化鉀壓片后, 進行紅外光譜測定.

1.2.5核磁共振氫譜分析取10 mg樣品溶于0.5 mL重水中, 進行1H NMR譜分析. 采用相關系數法測定譜圖的相似度, 將特征鑒別區(qū)譜圖峰型和峰位移值與均一糖肽MT2-A譜圖進行對比, 計算相關系數ρ. 如果相關系數ρ>0.95, 認為二者糖鏈結構一致; 反之, 則認為是糖鏈結構不一致.

1.2.6氨基酸組成分析稱取500 mg甘露聚糖肽樣品, 用10 mL鹽酸(6 mol/L)在充氮氣狀態(tài)下于110 ℃水解22 h后, 測定氨基酸組成, 檢測波長為570和440 nm.

1.2.7免疫原性測定取一定量樣品和甘露聚糖肽對照品, 分別加入氯化鈉注射液制成濃度為10 mg/mL的溶液, 再分別用磷酸鹽緩沖液制成1∶2, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32, 1∶64, 1∶128和1∶256(稀釋度積比)的稀釋液作為樣品溶液和對照品溶液. 取甘露聚糖肽對照品溶液及樣品溶液各0.1 mL置于試管中, 加入0.1 mL 2單位抗體及0.2 mL 2單位補體, 搖勻, 于4～8 ℃放置4 h以上, 于37 ℃下保溫30 min, 加入0.2 mL致敏羊血紅細胞, 搖勻, 于37 ℃下保溫30 min, 觀察各管溶血情況. 同時設抗原(不加抗體, 以0.1 mL磷酸鹽緩沖液代替)、 抗體(不加抗原, 以0.1 mL磷酸鹽緩沖液代替)、 補體(不加抗原、 抗體, 以0.2 mL磷酸鹽緩沖液代替)對照管, 以上3種對照管應全溶血; 另設的致敏羊血紅細胞(不加抗原、 抗體和補體, 以0.4 mL磷酸鹽緩沖液代替)對照管應不溶血. 樣品不溶血管的最低濃度應不得高于對照品相應濃度的1倍以上.

2結果與討論

2.1MT1-A, MT1-B和MT2-B的分子量及分布

采用DEAE-纖維素離子交換層析柱和Sephacryl S-300凝膠層析柱對發(fā)酵得到的甘露聚糖肽原料進行分離純化, 得到4種均一糖肽MT1-A, MT1-B, MT2-A和MT2-B. 采用高效凝膠過濾色譜法測定了MT1-A, MT1-B和MT2-B的分子量及分布(圖S1, 見本文支持信息). 采用GPC軟件計算得出MT1-A, MT1-B和MT2-B的重均分子量Mw分別為5.69×104, 1.55×104和3.28×104; 數均分子量Mn分別為3.77×104, 1.05×104和1.91×104. 上述3個均一糖肽的重均分子量及數均分子量均小于MT2-A[14].

2.2MT1-A, MT1-B和MT2-B的單糖組成

MT1-A, MT1-B及MT2-B經三氟醋酸(TFA)水解, PMP衍生化后進行高效液相色譜分析, 色譜圖見圖S2(見本文支持信息). 通過與相應標準單糖衍生物的保留時間進行比較發(fā)現, MT1-A, MT1-B和MT2-B的單糖組成均為甘露糖和葡萄糖, 其中絕大部分為甘露糖, 極少量為葡萄糖. 3種均一糖肽的單糖組成與MT2-A很相似.

2.3MT1-A, MT1-B和MT2-B的甲基化分析

MT1-A, MT1-B和MT2-B的甲基化分析結果與MT2-A幾乎完全相同, 甘露糖殘基均主要有1-, 1,2-, 1,3-, 1,6-和1,2,6-幾種連接方式; 葡萄糖因含量低, 葡萄糖殘基連接方式均未檢出.

2.4MT1-A, MT1-B和MT2-B的紅外光譜分析

由MT1-A, MT1-B和MT2-B的紅外光譜(圖S3, 見本文支持信息)可見, 3種均一糖肽的紅外光譜與MT2-A幾乎一致, 譜圖中顯示出多糖的典型吸收特征峰, 其中3422 cm-1處為O—H伸縮振動引起的強吸收峰, 2924 cm-1處的吸收峰為C—H的伸縮振動吸收峰; 1644 cm-1處的為糖結晶水的吸收峰; 1132和1059 cm-1處的吸收峰為C—O伸縮振動峰; 812 cm-1處的吸收峰為甘露糖殘基的特征吸收峰.

2.5MT1-A, MT1-B和MT2-B的1H NMR譜分析

由MT1-A, MT1-B和MT2-B的1H NMR譜(圖S4, 見本文支持信息)可見, 3種均一糖肽的1H NMR譜峰型及譜峰化學位移值與MT2-A幾乎完全一致. 譜圖信號主要集中在δ3.20～5.80之間, 分為異頭氫區(qū)(5.80～4.40)和環(huán)質子區(qū)(4.40～3.20) 2個區(qū)域. 根據文獻[14]對MT2-A的鑒定結果,δ5.29, 5.14, 5.12和5.08, 5.04, 4.90分別歸屬為1,2-, 1,3-, 1,2,6-, 末端和1,6-連接甘露糖殘基的異頭氫信號.

2.6MT1-A, MT1-B和MT2-B的氨基酸組成分析

將3種均一糖肽用鹽酸水解后, 測定其氨基酸種類及含量, 結果列于表1. 由表1可知, MT1-A, MT1-B和MT2-B中均含有16種氨基酸, 氨基酸總量分別為3.88%, 6.15%和9.11%.與MT2-A相比, MT1-A, MT1-B和MT2-B所含氨基酸種類相同, 但氨基酸總量有所差別.

2.74種均一糖肽的免疫原活性

補體結合實驗是利用競爭來實現的, 其中的反應系統(tǒng)(抗原與抗體)與指示系統(tǒng)[綿羊紅細胞(SRBL)與溶血素]爭奪補體系統(tǒng), 即當待測的標本中有相應的目標抗原(或抗體)時, 抗原抗體發(fā)生反應后可以結合補體, 再加入指示系統(tǒng)(SRBL與相應溶血素), 由于體系中沒有游離的補體, 不能與指示醫(yī)學系統(tǒng)發(fā)生反應, 也不會出現溶血現象, 即陽性實驗無溶血現象.

將批號為G100102的甘露聚糖肽原料以及其中分離出的4種均一糖肽與甘露聚糖肽對照品比對表明, 甘露聚糖肽原料及4種均一糖肽的最高稀釋度為1∶64, 與對照品相同, 均具有免疫活性.

2.8不同批次甘露聚糖肽原料的1H NMR譜分析

由于MT1-A, MT1-B和MT2-B的單糖組成、 糖殘基連接方式與MT2-A幾乎完全一致, 但分子量和氨基酸總量有所不同; 且4種均一糖肽均具有免疫活性, 因此推測甘露聚糖肽是由糖鏈結構一致、 分子量和氨基酸含量不同的幾種均一糖肽構成的混合物.

為了驗證甘露聚糖肽原料中是否還存在其它種類的糖肽或多糖, 測定了該批次甘露聚糖肽原料的1H NMR譜(圖S5, 見本文支持信息). 可見, 甘露聚糖肽原料的1H NMR譜與4種均一糖肽的譜圖峰型及峰位移值幾乎完全一致. 為了定量評價甘露聚糖肽原料和4種均一糖肽1H NMR譜的相似程度, 以MT2-A的1H NMR譜為標準譜圖, 異頭氫區(qū)域δ5.80～4.40為鑒定區(qū)域, 采用相關系數法計算甘露聚糖肽原料及另外3種均一糖肽譜圖與MT2-A譜圖的相似度, 結果列于表2, 可見各相關系數均大于0.95.

進一步測定了其它批次甘露聚糖肽原料的1H NMR譜, 并計算了原料譜圖與MT2-A譜圖的相關系數, 得出了相同的結論. 上述結果表明, 發(fā)酵法得到的甘露聚糖肽是由幾種糖鏈結構一致、 分子量和氨基酸含量不同的均一糖肽組成的混合物. 即使甘露聚糖肽原料中含有其它不同單糖組成或不同連接方式糖殘基的多糖或糖肽, 含量也應該很低, 在1H NMR譜中未顯示相關信號.

3結論

通過對甘露聚糖肽原料分離得到的幾種均一糖肽的結構和免疫活性的測定以及對不同批次甘露聚糖肽原料1H NMR譜的分析, 發(fā)現甘露聚糖肽是由糖鏈結構一致、 分子量和氨基酸含量不同的幾種均一糖肽構成的混合物. 在甘露聚糖肽的質量標準中可對其作如下定義: 甘露聚糖肽是由健康人咽喉部分離的α-溶血性鏈球菌33號菌株經深層培養(yǎng)、 發(fā)酵提取而得到的一種糖肽類物質, 主要由甘露糖組成, 還含有少量葡萄糖及氨基酸. 糖鏈主鏈由1,6-甘露糖殘基構成, 支鏈由1,2-, 1,3-和末端連接的甘露糖殘基構成, 在1,2,6-甘露糖殘基的O-2位形成分支點.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20160138.

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2.ChengduLierPharmaceuticalCo.,Ltd.,Chengdu610083,China)

(Ed.: P, H, S, K)

? Supported by the Scientific and Technological Achievement Transformation Project of Sichuan Province, China(No.2012SC0024).

Structural Characterization of Mannatide?

SHEN Yanhong1, CHEN Linxiao1, ZHANG Wenqing1, XU Zhizhen1,WAN Yanfei2, ZHANG Li2, XIA Wei1*

(1.ShanghaiKeyLaboratoryofFunctionalMaterialsChemistry,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China;

KeywordsMannatide; Polysaccharide; Structure

AbstractDEAE-52 cellulose column and Sephacryl S-300 gel column were used to isolate and purify mannatide to give four homogeneous glycopeptides termed as MT1-A, MT1-B, MT2-A and MT2-B. The chemical structure of MT1-A, MT1-B and MT2-B were elucidated using monosaccharide composition analysis, methylation analysis,1H-nuclear magnetic resonance(1H NMR) spectroscopy, infrared(IR) spectroscopy and amino acids analysis. It was concluded that the monosaccharide composition and connection type of sugar residues of MT1-A, MT1-B and MT2-A were the same as MT2-A reported before while the molecular weight and amino acid content of four homogeneous glycopeptides were slightly different. The1H NMR spectrum of MT2-A was regarded as the standard reference spectrum and the anomeric region of each spectrum(δ4.89—5.90) was selected as the identification region. The1H NMR spectra of MT1-A, MT1-B, MT2-A and different batches of mannatide were compared with the standard reference spectrum, using the correlation coefficient to quantitatively calculate the similarity. The results showed that mannatide was a mixture of several kinds of homoge-neous glycopeptides with the same glycan structure but different molecular weight and amino acid content.

收稿日期:2016-03-08. 網絡出版日期: 2016-05-26.

基金項目：四川省科技成果轉化項目(專項)(批準號: 2012SC0024)資助.

中圖分類號O629.12

文獻標志碼A

聯系人簡介: 夏瑋, 女, 博士, 副教授, 主要從事天然產物的開發(fā)研究. E-mail: xiawei1999@ecust.edu.cn