DNA條形碼技術(shù)在入侵植物刺萼龍葵檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用

田旭飛+曲波

摘要：刺萼龍葵（Solanum rostratum）是危害嚴(yán)重的外來(lái)入侵植物，基于種子形態(tài)的傳統(tǒng)檢疫方法有一定的局限性，不依賴于形態(tài)學(xué)特征的DNA條形碼技術(shù)是基于DNA序列差異對(duì)物種進(jìn)行鑒定的新方法，是傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法的有力補(bǔ)充。以刺萼龍葵及其8種龍葵亞屬近緣植物為材料，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載rbcL、matK和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列，進(jìn)行DNA條形碼分析，結(jié)果顯示ITS鑒定效果優(yōu)于其他片段，可把刺萼龍葵從其近緣植物中鑒別出來(lái)。

關(guān)鍵詞：刺萼龍葵；DNA條形碼；ITS序列；入侵植物

中圖分類號(hào)：S41-30文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1003-935X（2017）01-0030-06

Application of DNA Barcoding in Inspection and Quarantine of

the Invasive Plant Solanum rostratum

TIAN Xufei，QU Bo

（Bioscience and Biotechnology College，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

Abstract： Solanum rostratum is a seriously harmful invasive plant. The traditional method of identifying S. rostratum is by assessing its seed morphological characteristics，a procedure that cannot be realistically performed by customs officers because of many limitations. DNA barcoding is a technique for characterizing species of organisms using a short DNA sequence from a standard and agreed-upon position in the genome. As a powerful supplement to a conventional identification method，it is not affected by morphological traits of samples. In this study we downloaded rbcL，matK and ITS sequences for S. rostratum and its eight related species in Subg. Solanum from GenBank for DNA barcoding analyses. S. rostratum could be distinguished from its closely relative species with ITS being more effective than the other sequences at identifying the invasive plant.

Key words： Solanum rostratum；DNA barcoding；ITS sequence

收稿日期：2017-01-06

基金項(xiàng)目：遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金（編號(hào)：2015003013）

作者簡(jiǎn)介：田旭飛（1992—），男，貴州德江人，碩士，主要從事入侵生物學(xué)研究。

通信作者：曲 波，博士，教授，主要從事入侵生物學(xué)與生物多樣性保護(hù)研究。E-mail：syau_qb@163.com。刺萼龍葵（Solanum rostratum Dunal）是茄科茄屬龍葵亞屬一年生雜草，別稱黃花刺茄，原生于北美洲，現(xiàn)已廣泛分布世界各地，被許多國(guó)家列為檢疫性有害植物[1]。1981年刺萼龍葵首次在遼寧省朝陽(yáng)縣被發(fā)現(xiàn)[2]，現(xiàn)已擴(kuò)散至吉林、山西、新疆、內(nèi)蒙古、河北和北京等地[3-4]，已被我國(guó)列為檢疫雜草。刺萼龍葵具有極強(qiáng)的適生性和繁殖能力，種子具有休眠性，能抵抗不良環(huán)境，一旦成功入侵，危害巨大，會(huì)嚴(yán)重抑制其他植物生長(zhǎng)，降低生物多樣性[5]。

預(yù)防是最好的防治，目前各國(guó)都很重視雜草檢疫工作，但傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法難以滿足現(xiàn)在的快速檢疫需求，而一些先進(jìn)的分子技術(shù)還未轉(zhuǎn)變成切實(shí)可行的實(shí)踐方法[6-7]。目前對(duì)刺萼龍葵的檢疫檢測(cè)主要依據(jù)其種子的形態(tài)特征，而其種子通常夾雜在糧食、羊毛及交通工具中，與其他植物種子混雜在一起，且運(yùn)輸時(shí)會(huì)發(fā)生磨損，使形態(tài)特征丟失，導(dǎo)致與其他很多雜草種子的外觀相差不多，鑒定更加困難。

DNA條形碼（DNA barcoding）是一種基于DNA序列進(jìn)行生物物種鑒定的技術(shù)，即利用標(biāo)準(zhǔn)化的1個(gè)或者幾個(gè)DNA片段進(jìn)行序列分析，根據(jù)核苷酸序列差異，對(duì)物種進(jìn)行快速和準(zhǔn)確鑒定[8]。DNA條形碼技術(shù)不依賴形態(tài)學(xué)特征，可作為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)檢疫檢驗(yàn)的有力補(bǔ)充。一個(gè)物種如果能和它親緣關(guān)系最近的物種分開，就能與其他物種分開從而被成功鑒定，外來(lái)入侵植物如果能與其同屬的近緣物種分開，就能被成功檢疫。因此，本研究選擇刺萼龍葵及其同亞屬的8種近緣植物作為分析對(duì)象，以生物條形碼聯(lián)盟（Consortium for the Barcode of Life，簡(jiǎn)稱CBOL）推薦的rbcL和matK的核心條形碼片段，以及在國(guó)內(nèi)外條形碼研究中得到廣泛認(rèn)可的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列作為研究片段，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的刺萼龍葵和龍葵亞屬中的近緣種序列，對(duì)ITS、rbcL和matK 3種序列進(jìn)行DNA條形碼分析。

1 材料與方法

1.1 DNA序列獲取

本研究以刺萼龍葵及龍葵亞屬中的龍葵（S.nigrum）、假煙葉樹（S.verbascifolium）、旋花茄（S.spirale）、紅果龍葵（S.alatum）、珊瑚櫻（S.pseudocapsicum）、歐白英（S.dulcamara）、海桐葉白英（S.pittosporifolium）及馬鈴薯（S.tuberosum）8種近緣種植物作為研究對(duì)象，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載相應(yīng)的rbcL、matK及ITS序列，得到rbcL序列52條，matK序列41條，ITS序列27條，相應(yīng)登錄號(hào)見表1。

1.2 序列分析

用Mega 5.1軟件計(jì)算序列間的K2P（Kimura-2-Parameter distance）距離，獲得種間變異、種間最小變異、種內(nèi)變異、種內(nèi)最大變異等一系列數(shù)據(jù)；通過TaxonDNA軟件比較序列在種內(nèi)、種間的變異分布，構(gòu)建柱狀統(tǒng)計(jì)圖，評(píng)估Barcoding Gap；用Mega 5.1軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹，根據(jù)各物種在樹中的位置，評(píng)估不同候選序列對(duì)以上幾種植物鑒定的有效性。在NJ系統(tǒng)樹中，如果刺萼龍葵及其他物種都自成單系，則鑒定成功。

采用最近距離法（Nearest Distance）考察序列的鑒定成功率，計(jì)算待鑒定DNA條形碼序列與其他樣品序列（含已知的刺萼龍葵DNA序列）間的遺傳距離（K2P），如果待鑒定DNA條形碼序列與其中刺萼龍葵DNA序列的遺傳距離最小，則鑒定成功，反之則失敗。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

經(jīng)剪切校正后，刺萼龍葵rbcL、matK、ITS序列的長(zhǎng)度分別為615、735、632 bp，長(zhǎng)度均符合DNA條形碼片段要求，且有較多的信息位點(diǎn)數(shù)和變異位點(diǎn)數(shù)（表2）。根據(jù)K2P值分析結(jié)果，刺萼龍葵各序列的種間差異大小順序?yàn)镮TS>matK+ITS>matK+rbcL>rbcL+ITS>matK>rbcL；種內(nèi)差異大小順序?yàn)椋篒TS>matK>matK+ITS>rbcL>rbcL+ITS>matK+rbcL。其中ITS及rbcL+ITS組合片段序列的種內(nèi)最大變異遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于種間最小變異，最為理想（表3）。

2.2 BarcodingGap分析

BarcodingGap分析結(jié)果表明，ITS種內(nèi)的遺傳距離變異集中在K2P數(shù)值（最大0.08）較小的左側(cè)，種間遺傳距離變異集中在數(shù)值較大的右側(cè)（圖1）；rbcL+ITS遺傳距離變異集中在K2P數(shù)值（最大0.03）較小的左側(cè)，種間遺傳距離變異集中在數(shù)值（K2P最小值為0.05）較大的右側(cè)（圖2），滿足DNA條形碼的BarcodingGap條件。

2.3 鑒定效果分析

從基于ITS序列所構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可以看出，刺萼龍葵的ITS序列聚類在一起，其他8種龍葵亞屬植物的同種不同個(gè)體也以較高的支持率聚在一起，鑒別效果達(dá)到100%。rbcL+ITS序列所構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹聚類效果稍差。經(jīng)最近距離法分析，ITS在龍葵亞屬中的鑒別效果為100%。

rbcL+ITS序列組合的鑒定效果與單用ITS序列相差不大，但單用ITS序列操作更方便，因此選擇ITS序列作為茄科龍葵亞屬的DNA條形碼。

3 討論與結(jié)論

理想的DNA條形碼既要有一定的保守性以便于設(shè)計(jì)通用引物，又要有足夠的變異以區(qū)分不同的物種，目前還沒有找到這種理想的、通用的植物DNA條形碼[9]，因此提出分層次的植物DNA條形碼鑒定方法，即以相對(duì)保守序列鑒定高級(jí)分類層次，如科、屬，以變異更快的序列鑒定種[10]。不同植物類群最適的DNA條形碼序列可能不同；不同的DNA條形碼序列也可能適用于相同的植物類群。

本研究中，ITS序列在龍葵亞屬種的種內(nèi)變異為0.023 1，種間變異為0.142 8，比rbcL和matK及各組合片段的鑒別效果更好。張偉等以茄屬的26份樣品為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)trnS-trnG、ndhF和waxy這3個(gè)片段組合能從近緣種中鑒別銀毛龍葵（Solanum elaeagnifolium），對(duì)茄屬植物有較強(qiáng)的分辨力[11]。但trnS-trnG、ndhF和waxy這3個(gè)片段需要組合使用，序列長(zhǎng)，在其他植物類群中的研究也較少，在實(shí)踐應(yīng)用中有一定局的限性。本研究以matK、rbcL和ITS為研究序列，發(fā)現(xiàn)ITS 1個(gè)序列的鑒別力很好，可作為茄屬植物的DNA條形碼。ITS序列變異速率較快，在早期的植物分子鑒定中應(yīng)用很多，因此各數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)ITS的序列很多，目前也是植物DNA條形碼研究的熱門候選片段之一。朱珣之等利用ITS2對(duì)17種入侵植物及其36種近緣植物進(jìn)行DNA條形碼分析，在300份樣品中鑒定準(zhǔn)確率高達(dá)95.5%，種間變異明顯大于種內(nèi)變異[12]。胡志剛以63個(gè)菊科藥用植物樣本為材料，發(fā)現(xiàn)ITS序列能正確鑒定到種的成功率為87.3%，有良好的鑒別能力[13]。ITS對(duì)冬蟲夏草、花椒等也有很好的鑒定效果[14-16]。在更多類群中以ITS序列作為DNA條形碼開展研究，若能證明ITS序列的鑒別能力很好，把ITS序列作為核心條形碼，可以利用已有的ITS序列數(shù)據(jù)，在構(gòu)建

植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)可以節(jié)省更多的人力和物力。

matK和rbcL是生物條形碼聯(lián)盟推薦的核心條形碼序列，在植物DNA條形碼研究中有著重要的意義，但隨著研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)rbcL和matK由于分子進(jìn)化速率較慢，在種級(jí)水平上，特別是對(duì)于那些經(jīng)歷了近期適應(yīng)輻射或快速進(jìn)化的屬來(lái)說，分辨率較低[17-21]，因此適合作為高級(jí)分類層次的鑒定，不適合種級(jí)水平鑒定，這與本研究結(jié)果相符。

致謝：感謝沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)馮玉龍教授給本文提出的寶貴建議。

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