THZ時(shí)域光譜技術(shù)在生物DNA鑒定中的應(yīng)用

王 芳，蔡 蒙，劉云飛

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THZ時(shí)域光譜技術(shù)在生物DNA鑒定中的應(yīng)用

王 芳1,2，蔡 蒙2，劉云飛1

（1. 南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037；2. 三江學(xué)院，江蘇 南京 210012)

利用太赫茲時(shí)域光譜技術(shù)研究了松材線蟲、擬松材線蟲、鯡魚、鮭魚和白楊等不同DNA分子的吸收光譜，分析發(fā)現(xiàn)：隨著樣品厚度的減少，吸收峰會(huì)發(fā)生簡(jiǎn)并現(xiàn)象；折射率也會(huì)隨著樣品厚的增加而增加。通過比較不同DNA分子的吸收譜還發(fā)現(xiàn)：相似物種DNA分子比不同物種具有更多重合的吸收峰，推測(cè)這跟DNA分子內(nèi)堿基排序有關(guān)。在DNA檢測(cè)方面，傅里葉紅外光譜儀和太赫茲光譜儀配合使用，可以從光譜的寬度和精度上互補(bǔ)，發(fā)揮更大優(yōu)勢(shì)。最后得到幾種不同DNA分子所有吸收峰位置，這為今后建立DNA太赫茲光譜數(shù)據(jù)庫(kù)和鑒別DNA大分子奠定基礎(chǔ)。

吸收頻率；折射率；DNA；太赫茲時(shí)域光譜技術(shù)

0 引言

太赫茲（THz）輻射是位于0.1～10THz頻率范圍的紅外電磁光譜。大量實(shí)驗(yàn)表明，太赫茲輻射不會(huì)對(duì)基因組造成傷害[1]。太赫茲波段的吸收光譜反映了低頻率的分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)，這是依賴于雙螺旋堿基對(duì)的弱氫鍵[2]。近年來，研究DNA（脫氧核糖核酸）光譜的文章有很多，但大部分都位于近紅外、中紅外和部分遠(yuǎn)紅外的范圍[3]。D. L. Woolard等人[4]研究了10～25cm－1（0.3～0.75THz）頻率范圍內(nèi)鯡魚和鮭魚的DNA透射譜，發(fā)現(xiàn)了許多相同和不同的聲子模式，然而，并沒有詳細(xì)研究吸收峰與內(nèi)部結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。BM Fischer等人[5]通過密度泛函理論（density functional theory，DFT）對(duì)胸腺嘧啶的四聚體單元進(jìn)行計(jì)算，獲得的4個(gè)低頻紅外活性振動(dòng)模式均來源于這兩組氫鍵面內(nèi)振動(dòng)和面外振動(dòng)的分子間運(yùn)動(dòng)。

本文利用THz時(shí)域光譜技術(shù)研究了松材線蟲（，簡(jiǎn)稱Bx），擬松材線蟲（，簡(jiǎn)稱Bm），鯡魚（herring），鮭魚（salmon），白楊（aspen）等5種不同DNA樣品的透射譜。Bx是一種外來入侵物種，可對(duì)松樹帶來巨大災(zāi)難，Bm是一種生活在健康松樹上的無害昆蟲，Bx和Bm在外形上看不出任何差別，它們同屬于線蟲科；鯡魚和鮭魚屬于脊索動(dòng)物門，白楊是植物。本文利用太赫茲光譜儀（有效頻率范圍0.5～2.5THz）和傅里葉紅外光譜儀（有效頻率范圍1～9THz），分別得到5種DNA樣品的吸收譜，并比較了不同樣品、不同純度樣品以及不同厚度樣品的吸收系數(shù)和折射率。

1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與實(shí)驗(yàn)原理

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

測(cè)試DNA分子采用的是日本ADVANTEST公司tas7500系列太赫茲光譜儀和傅里葉紅外光譜儀，可獲得低能量下，包括分子間相互作用的光譜信息，由此來分析晶體化合物的屬性[6]。圖1(a)顯示了太赫茲脈沖通過背景（聚乙烯粉末）和樣品（脫氧核糖核酸）前后的時(shí)域譜，圖1(b)是其對(duì)應(yīng)的功率譜。

圖1 THz脈沖通過Bm-DNA前后的時(shí)域譜和對(duì)應(yīng)的功率譜

1.2 樣品制備和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)中用到的鯡魚和鮭魚DNA樣品購(gòu)于西格瑪公司。鯡魚樣品為純度高于90%的凍干粉，可直接與PET（Polyethylene，聚乙烯）粉末均勻混合壓片測(cè)試；鮭魚樣品為純度高于90%的絮狀物，需用蒸餾水充分溶解后與PET粉末混合攪拌均勻，放入60℃的烘箱烘干，研磨均勻后壓片測(cè)試。實(shí)驗(yàn)中用到的松材線蟲、擬松材線蟲和白楊DNA樣品為實(shí)驗(yàn)室自行提取，樣品為液體，需與一定量的PET粉末均勻混合后，放入烘箱60℃烘干，研磨均勻后壓片測(cè)試。

1.3 樣品厚度計(jì)算

為了測(cè)出樣品厚度對(duì)光譜的影響，實(shí)驗(yàn)中需要制備不同厚度的樣品，具體方法如下：

假設(shè)需要制備的樣品厚度為，樣品由2種純凈物（A和B）組成，混合物中A和B的比例為1:2，需要通過計(jì)算得到混合物中所需A和B的質(zhì)量。過程如下：

1）準(zhǔn)備一個(gè)精度為萬(wàn)分之一克的天平，分別稱取一定質(zhì)量的純樣品A和B，質(zhì)量記為1和2克；

2）給壓片機(jī)施加2kN的壓力將樣品壓成表面光滑，厚度均勻的薄片；

3）用精度為千分之一毫米的測(cè)厚儀測(cè)出純樣品A和B的厚度分別為1和2；

4）利用公式：

計(jì)算出純樣品A和B的密度分別為1和1，其中為第一步稱取樣品的質(zhì)量，為第三步測(cè)量樣品的厚度，為樣品半徑（該參數(shù)固定為13mm）；

5）利用公式：

計(jì)算出厚度為的樣品所需純樣品A和B的質(zhì)量分別為1和2：

6）根據(jù)第五步計(jì)算出的質(zhì)量稱取純樣品A和B，混合均勻后壓成厚度均勻的薄片；

7）利用測(cè)厚儀測(cè)量樣品厚度對(duì)結(jié)果進(jìn)行校驗(yàn)。經(jīng)過反復(fù)多次測(cè)試，誤差均在5%范圍以內(nèi)，隨著樣品厚度的增加精度也相應(yīng)的提高。

1.4 吸收系數(shù)和折射率的計(jì)算

為了找到樣品特征，需要原始時(shí)域數(shù)據(jù)計(jì)算出樣品的折射率，吸收系數(shù)和透光率。其中，樣品的原始時(shí)域數(shù)據(jù)通過光譜儀測(cè)得，為了減小基線偏移，將獲得的原始時(shí)域數(shù)據(jù)減去原始時(shí)域數(shù)據(jù)的平均值，得到樣品的功率譜如下：

假設(shè)s()和r()分別是樣品和背景的對(duì)數(shù)譜，樣品的透光譜可以被表示為：

Transmittance(log)＝s()－r() (8)

Transmittance(%)＝10(Transmittance(log)/10)×100 (9)

最后，得到樣品的吸收系數(shù)和折射率：

式中：是樣品厚度，cm；e是自然對(duì)數(shù)；是光速；()是樣品和參考的相位差。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 不同純度和厚度樣品的光譜研究

利用太赫茲光譜儀測(cè)試了不同厚度鯡魚DNA樣品的折射率和吸收系數(shù)。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)空氣，樣品和的聚乙烯在0.1～0.5THz頻率范圍的吸收譜非常相似，如圖2(a)所示，推測(cè)是由儀器靈敏度低造成的。圖2(b)為0.5～2.5THz光譜范圍內(nèi)，利用太赫茲光譜儀測(cè)得的不同厚度（0.3mm，0.47mm，1.07mm）鯡魚DNA樣品的吸收系數(shù)，圖2(c)為1～9THz光譜范圍內(nèi)，利用傅里葉紅外光譜儀測(cè)得的不同厚度（0.5mm，1mm）鯡魚DNA樣品的吸收系數(shù)。由于樣品吸收曲線的基線不同，很難比較不同樣品的吸收特性。因此，對(duì)吸收曲線九點(diǎn)平滑后求其二階導(dǎo)數(shù)再取反，從圖2(d)可以發(fā)現(xiàn)吸收特征更加明顯且吸收峰的位置與圖2(a)相比并無變化。分析還發(fā)現(xiàn)，隨著樣品厚度的減小，吸收峰發(fā)生簡(jiǎn)并現(xiàn)象，這不同于D.L.Woolard[4]等人的研究，D.L.Woolard等人認(rèn)為樣品吸收與樣品厚度無明顯關(guān)系，他們研究的樣品厚度均小于220mm，但在這里，樣品厚度超過了500mm。

圖2 不同厚度樣品的太赫茲光譜比較

本文還比較了不同純度鮭魚DNA樣品的太赫茲光譜，圖3(a)給出了0.5～2.5THz光譜范圍內(nèi)不同純度的鮭魚DNA樣品吸收系數(shù)的二階導(dǎo)數(shù)取反，比較發(fā)現(xiàn)，純樣品因?yàn)槲仗珡?qiáng)烈，吸收峰的位置和強(qiáng)度與混合了聚乙烯的樣品有很大區(qū)別，反復(fù)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，20%～50%純度的鮭魚DNA樣品的吸收峰是最好辯認(rèn)的，純度低于10%會(huì)導(dǎo)致吸收峰太弱難以檢測(cè)。樣品的最佳純度取決于樣品本身，要通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得。利用公式(11)，計(jì)算出不同厚度的鯡魚DNA樣品的折射率，如圖3(b)所示，隨著樣品厚度的增加，折射率也在相應(yīng)的增加。折射率是物質(zhì)的固有屬性，在理論上并不隨著樣品厚度的改變而改變，但應(yīng)該注意的是，理論和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有一定的誤差，而這種誤差與厚度成正比[7]。所以，只有當(dāng)樣品的厚度相同時(shí)，比較不同樣品的折射率才有意義。

2.2 不同DNA樣品太赫茲光譜比較

測(cè)試了0.5～2.5THz范圍內(nèi)5種不同DNA樣品的太赫茲光譜。發(fā)現(xiàn)，松材線蟲和擬松材線蟲DNA，鯡魚和鮭魚DNA有許多相同的聲子模式，如圖4所示，松材線蟲和擬松材線蟲DNA有22個(gè)共同的吸收峰和14個(gè)特有的吸收峰（松材線蟲10個(gè)，擬松材線蟲4個(gè)），鯡魚和鮭魚DNA有22個(gè)共同的吸收峰和20個(gè)特有的吸收峰（鯡魚8個(gè)，鮭魚12個(gè)）。

圖3 不同純度樣品太赫茲光譜比較以及不同厚度樣品折射率比較

圖4 同源物種DNA太赫茲光譜比較

Fig.4 Terahertz spectrum of the similar species DNA

還比較了不同物種的DNA吸收光譜，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物（鯡魚）DNA和植物（白楊）DNA在0.5～2.5THz范圍內(nèi)大約有13個(gè)相同的吸收峰和24個(gè)特有的吸收峰（鯡魚16個(gè)，白楊8個(gè)），如圖5所示。說明同源的物種較不同物種有更多相同的吸收峰。所以我們推斷太赫茲時(shí)域光譜（THz-TDS）技術(shù)是識(shí)別不同物質(zhì)DNA的一個(gè)有效工具。但是，由于吸收峰的位置太多，目前無法分辨出特征峰的位置。

圖5 0.5～2.5THz光譜范圍內(nèi)鯡魚和白楊DNA樣品吸收系數(shù)的二階導(dǎo)數(shù)取反

2.3 不同DNA樣品傅里葉紅外光譜比較

利用傅里葉紅外光譜儀并配合不同波長(zhǎng)的分束器（6mm、25mm、50mm），得到了不同DNA樣品的吸收譜，發(fā)現(xiàn)當(dāng)分束器波長(zhǎng)大于50mm時(shí)，得到的吸收譜近似于太赫茲光譜儀測(cè)得的結(jié)果，故在此省略介紹。圖6(a)為利用6mm分束器，得到的0.5mm鯡魚DNA樣品的紅外吸收譜。圖6(b)為利用25mm分束器，得到的0.5mm鯡魚DNA樣品紅外吸收譜。圖6(c)為利用6mm分束器，得到的0.5mm松材線蟲和擬松材線蟲DNA樣品紅外吸收譜。

比較發(fā)現(xiàn)，不同于太赫茲光譜儀測(cè)得的結(jié)果，利用6mm分束器，傅里葉紅外光譜儀可以清晰的測(cè)得不同DNA樣品的特征峰位置和光譜形狀。從圖6(c)可以看出，相似物種DNA樣品吸收譜形狀和吸收峰位置都比較接近，只存在一些細(xì)小的區(qū)別，如弱吸收峰位置、吸收強(qiáng)度、吸收峰寬度，這說明相似物種DNA分子中絕大部分堿基排列一致。比較圖6(a)和6(c)發(fā)現(xiàn)，不同物種DNA樣品吸收光譜形狀和吸收峰位置存在很大差別。所以，利用吸收譜的形狀和吸收峰的位置可以對(duì)不同物種DNA作出快速鑒別。

經(jīng)過多次重復(fù)測(cè)試，得到幾種DNA樣品的特征峰位置，為將來建立DNA分子光譜數(shù)據(jù)庫(kù)奠定基礎(chǔ)。如：鯡魚在3.09THz有一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，在5.6THz有一個(gè)非常強(qiáng)且很寬的吸收包絡(luò)，在7.3THz有一個(gè)弱吸收峰；擬松材線蟲和松材線蟲在5.3THz均有一個(gè)非常強(qiáng)的吸收峰，在3.8THz和7.3THz存在弱吸收峰，在3.3THz存在一個(gè)共同的吸收谷，但是在5.3THz處吸收峰的寬度和強(qiáng)度不一樣，這可以為鑒別擬松材線蟲和松材線蟲提供依據(jù)。從圖6(a)和6(c)我們還作出一個(gè)大膽的推測(cè)，5.3THz處的弱吸收峰是鯡魚、松材線蟲、擬松材線蟲DNA分子的共同特征造成的。為了進(jìn)一步找出每種DNA樣品的特征峰位置，為DNA快速無損檢測(cè)奠定基礎(chǔ)，今后我們的研究?jī)?nèi)容包括：測(cè)試更多的樣品找出DNA分子吸收譜的規(guī)律，從堿基、堿基對(duì)、DNA片段開始深入研究，并結(jié)合Gaussian、Amber等軟件，利用分子動(dòng)力學(xué)理論對(duì)吸收譜作出解釋，給實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提供支撐。

圖6 不同DNA樣品的傅里葉紅外光譜

3 結(jié)論

經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合太赫茲時(shí)域光譜技術(shù)，利用太赫茲光譜儀和傅里葉紅外光譜儀，得到松材線蟲、擬松材線蟲、鯡魚、鮭魚和白楊等5種不同物質(zhì)DNA（脫氧核糖核酸）的太赫茲光譜，找到了這些DNA大分子的吸收峰位置，這為以后建立DNA數(shù)據(jù)庫(kù)和DNA鑒定提供了一種新的方法。研究結(jié)果表明：在DNA光譜研究方面，傅里葉紅外光譜儀能更清楚地獲得DNA分子吸收譜形狀和特征峰位置，同源物種的吸收譜擁有相似的形狀和更多相同的吸收峰位置，只是在弱吸收峰位置、吸收峰寬度和強(qiáng)度上存在細(xì)小區(qū)別。可惜的是，研究只是發(fā)現(xiàn)了這些物質(zhì)的吸收峰位置，并不能確定這些特征頻率對(duì)應(yīng)的聲子模式，還需要借助分子動(dòng)力學(xué)模型來對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)一步確定。此外，還比較了不同厚度鯡魚DNA樣品的吸收系數(shù)和折射率，結(jié)果表明：隨著樣品厚度的減少，吸收峰出現(xiàn)簡(jiǎn)并現(xiàn)象，折射率也會(huì)隨著樣品厚度的增加而增加。研究還發(fā)現(xiàn)，樣品的吸收峰的位置和強(qiáng)度與樣品純度有很大關(guān)系，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)，才能找到最佳測(cè)試樣品的厚度。

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Application of THZ Time Domain Spectroscopy Technologyin Creature DNA Identification

WANG Fang1,2，CAI Meng2，LIU Yunfei1

(1.,210037,; 2.,210012,)

In this paper, the transmission spectral characteristics of Bx-DNA, Bm-DNA, herring-DNA, salmon-DNA and aspen-DNA have been studied by terahertz-time domain spectroscopy (THz-TDS) in the frequency range of 0.5-2.5THz. The absorption peaks have the phenomenon of merger when the thickness of the samples decrease, and the refractive index increases as the thickness of the samples increasing. By comparing with the absorption coefficient of different kinds of DNA molecules, we have found that the homologous species have more same absorption peaks than different species. In the detection of DNA, use of Fourier infrared spectrometer and terahertz spectrometer can obtain the accuracy and width of the spectra simultaneously. We also have picked up different DNA samples of which absorption peaks are in the frequency range of 0.5-2.5 THz in the experiments and we want to establish the database of DNA terahertz spectroscopy and identify the DNA macromolecules.

absorption frequency，refractive index，DNA，THz-TDS

O433

A

1001-8891(2016)04-0342-06

2015-10-01；

2016-03-10.

王芳（1984-），女，漢，江蘇鹽城人，博士研究生，講師，研究方向?yàn)闊o損檢測(cè)技術(shù)。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31170668和31200541）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012417）；江蘇省高等教育機(jī)構(gòu)優(yōu)勢(shì)學(xué)科項(xiàng)目（PAPD）。