急性髓細胞白血病p73基因啟動子區(qū)域異常甲基化的研究

潘少君　王俊和　李玉云　郝艷梅　胡忠利

蚌埠醫(yī)學院；①蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液科　安徽蚌埠　233030

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急性髓細胞白血病p73基因啟動子區(qū)域異常甲基化的研究

潘少君王俊和李玉云郝艷梅胡忠利①

蚌埠醫(yī)學院；①蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液科安徽蚌埠233030

[摘要]①目的探討急性髓細胞白血病(Acute Myeloid Leukemia ，AML)患者p73啟動子CpG島的甲基化狀況及其臨床意義。②方法采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MS-PCR)檢測56例AML患者骨髓單個核細胞p73啟動子區(qū)域甲基化率，同時以30例缺鐵性貧血患者作為對照組。χ2檢驗分析其甲基化程度與臨床參數(shù)之間的關(guān)系。③結(jié)果AML組p73甲基化率26%，正常對照組3%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。異常核型急性髓細胞白血病 (karyotypically abnormal AML,KA-AML)組p73甲基化率43%，顯著高于正常核型急性髓細胞白血病(cytogenetic normal AML,CN-AML)組(14%)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。AML低危組p73甲基化率為60%、AML中危組為21%、AML高危組為33%，3組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。④結(jié)論AML患者p73甲基化顯著高于對照組，提示p73可能參與AML的發(fā)生發(fā)展；p73在KA-AML中更易發(fā)生啟動子區(qū)域的甲基化；p73甲基化可能不足以成為AML獨立的預后指標。

[關(guān)鍵詞]p73甲基化急性髓細胞白血病甲基化特異性聚合酶鏈反應

Study of aberrant p73 promoter methylation in patients with acute myeloid leukemia

PANShaojun,WANGJunhe,LIYuyun,etal

(BengbuMedicalCollege,DepartmentofLaboratoryMedicine,AnhuiBengbu233030,China)

[ABSTRACT]ObjectiveTo study the methylation status of p73 promoter in patients with acute myeloid Leukemia and explore its significance with clinical data．MethodsMethylation of p73 promoter in bone marrow cells from 56 AML patients and 30 iron deficiency anemia controls were detected by methylation spfecific PCR(MSP)．The changes of p73 methylation status were measured and analyzed with correlated clinical data by chi-square test.ResultsThe prevalence of DNA methylation of p73 gene in AML patients was significantly higher than that in control group (26%vs3%,P<0.05),The prevalence of DNA methylation of p73 in karyotypically abnormal AML (43%) was significantly higher than that in cytogenetic normal AML(14%)(P <0.05) while there was no statistical difference of p73 methylation frequency was seen among the three groups of the low risk group (60%), medium-risk group (21%) and high-risk groups of AML (33%) (P>0.05).Conclusionp73 gene methylation was significantly higher than the control group,suggesting that p73 gene may be involved in the development of AML. p73 promoter region was more susceptible to methylate in the KA-AML than CN-AML.p73 methylation may not be AML independent prognostic indicator.

[KEYWORDS]p73 methylation.Acute myeloid leukemia. Methylation specific polymerase chain reaction

經(jīng)典抑癌基因p53家族成員p73是由學者Kaghad1977年發(fā)現(xiàn)，與p53易突變的特性不同，p73很少突變，又可轉(zhuǎn)錄表達具有不同功能的蛋白質(zhì)異構(gòu)體。p73在p1啟動子作用下，可轉(zhuǎn)錄TAp73，誘導細胞凋亡；在p2啟動子作用下轉(zhuǎn)錄DNp73，抑制細胞凋亡，發(fā)揮癌基因作用，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后等方面具有重要的意義[1]。有研究表明p73在一些血液系統(tǒng)腫瘤中異常甲基化的情況比較常見[2]。本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MS-PCR)方法對急性髓細胞白血病(AML)患者進行p73甲基化檢測，并探討其臨床意義。

1資料與方法

1.1研究對象初診AML患者56例，男30例，女26例;正常核型急性髓細胞白血病(CN-AML)35例，異常核型急性髓細胞白血病(KA-AML)21例；低危組5例，中危組39例，高危組12例[根據(jù)NCCN預后分組[3]可將AML患者分為3組:預后良好組(低危組)：t(8;21)/AMLl(CBFa)-ETO、inv(16)/t(16;16)/CBFβ-MYH11和t(15;17)/PML-RARa;預后中等組(中危組)：正常核型、tri8、t(9；ll)和其他無明確意義染色體異常;預后不良組(高危組)：復雜核型、-7、7q-、Ilq23/MLL(非t(9;11))、t(9;22)/BCR-ABL]。選擇缺鐵性貧血患者30例作為對照組，男17例，女13例，標本來源于蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液科收治患者的骨髓液，中位年齡49歲。56例AML患者均為臨床表現(xiàn)、細胞形態(tài)學、組織化學染色及免疫、細胞遺傳學、分子生物學分型確診。

1.2實驗方法

1.2.1RNA的提取與PCR。用Trizol提取液提取細胞總RNA，溶于20μL DEPC水并鑒定其純度及完整性，-80℃保存?zhèn)溆?，合成cDNA進行PCR擴增。

1.2.2引物。引物分別為p73-MF GGA CGT AGC GAA ATC GGG GTT C p73-MR ACC CCG AAC ATC GAC GTC CG；p73-UF AGG GGA TGT AGT GAA ATT GGG GTT T p73-UR ATC ACA ACC CCA AAC ATC AAC ATC CA；TAp73-F CGG GAC GGA CGC CGA TG TAp73-R GAA GGT CGA AGT AGG TGC TGT CTG G；DNp73-F ACT AGC TGC GGA GCC TCT C DNp73-R TGC TAG CAG ATT GAA CTG G。

1.2.3MSP檢測方法。①硫化DNA：提取標本中的DNA，紫外分光光度計測定其純度及濃度，取500ng DNA按照說明書進行硫化修飾，測定硫化后DNA的純度及濃度并置-80℃冰箱保存。②MSP：反應體系25μL，硫化DNA 2μL，上、下游引物均為0.5μL,反應條件:95℃ 3min、94℃30s，引物退火溫度(TM)60℃ 30s、72℃ 60s，40個循環(huán)；72℃ 5min。③凝膠電泳MSP產(chǎn)物分析：MSP產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，結(jié)束后在凝膠成像儀上分析并照相。去離子水作為空白對照。

1.2.4判定標準。甲基化(M)判定標準：僅有甲基化引物特異性擴增產(chǎn)物或甲基化和非甲基化引物均有特異性擴增產(chǎn)物；非甲基化(U)判定標準：僅有非甲基化引物特異性擴增產(chǎn)物。

1.3統(tǒng)計學方法率的比較采用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果

2.1AML組和對照組p73基因甲基化率比較56例AML患者的p73甲基化率為26%(15/56)，對照組p73甲基化率低3%(1/30)，見圖1。兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

注：U非甲基化引物擴增，M甲基化引物擴增

組別例數(shù)(n)陽性陽性率(%)χ2P值A(chǔ)ML組5615267.0950.008* M17571.419.3710.000# M217317.62.8550.091 M416318.83.1240.770 M5123252.4940.114 M641252.9930.084對照組3013

注：與對照組比較，*P<0.01;與對照組比較，#P<0.01。

2.2CN-AML與KA-AML患者p73甲基化率的比較CN-AML患者的p73甲基化率為14%(5/35)，KA-AML患者p73甲基化率43%(9/21)，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2　兩組AML患者p73基因甲基化率比較

注：與KA-AML組比較，*P<0.05

2.3AML患者低危組、中危組和高危組3組間p73甲基化率比較低危組AML患者p73甲基化率為60%(3/5)，中危組為21%(8/39)，高危組為33%(4/12)，3組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.145>0.05)，見表3。

表3　3組AML患者p73基因甲基化率的比較

注：3組之間比較，*P>0.05

2.4p73甲基化的AML患者TAp73與DNp73表達情況p73甲基化AML患者TAp73陽性率20%(3/15),對照組TAp73陽性率90%(27/30)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(圖2，表2)；p73甲基化AML患者DNp73陽性率100%(15/15)，對照組DNp73陽性率83.3%(25/30)，二者比較差異無統(tǒng)計學意義，見圖2，表2。

圖2　RT-PCR檢測TAp73、DNp73表達

組 別nTAp73-+DNp73-+p73甲基化AML組15123015對照組30327525

注：p73甲基化AML組和對照組TAp73陽性率比較，χ2=22.05,P<0.05;p73甲基化AML組和對照組DNp73陽性率比較，χ2=2.813,P>0.05。

3討論

AML是一種由原始造血干細胞增殖失控,反復細胞遺傳學異常的異質(zhì)性疾病，大部分AML患者具有正常核型，然而在這些患者中，通常很難預測長期預后[4]。CN-AML患者新型分子標記物,包括FLT3mt或NPM1ITD以及抑癌基因甲基化已有報道跟預后有關(guān)[5]。 前者已得到廣泛臨床實踐，后者尚未證明是有用的預后指標，由于有些白血病缺乏染色體(基因)的改變，表觀遺傳變化甲基化可能是導致疾病發(fā)生的主要因素，于是經(jīng)典抑癌基因家族成員p73甲基化的研究成了研究熱點。目前已有大量資料研究表明在急性淋巴細胞白血病中，p73甲基化使其自身表達缺失，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而p73在AML的甲基化狀態(tài)及是否與疾病預后相關(guān)國內(nèi)外尚未見報道。本研究采用MSP方法檢測AML中p73的甲基化情況，結(jié)果顯示：AML患者的p73甲基化率為26%，明顯高于對照組(3%)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，這提示p73甲基化可能參與了AML發(fā)生發(fā)展。AML的亞組中除了M1組與對照組間差異有統(tǒng)計學意義,其他各亞組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，但需要說明的是亞組例數(shù)偏少，需要擴充病例進一步研究。我們還將p73甲基化的15例AML患者標本進行TAp73和DNp73檢測，結(jié)果顯示DNp73均表達，且其中12例患者出現(xiàn)TAp73的缺失，這提示p73甲基化可能和TAp73缺失有關(guān)，TAp73可能有抑制AML發(fā)生的作用。p73甲基化可能使促凋亡功能的TAp73表達缺失，而起著抑制凋亡作用的DNp73可能促進了AML的發(fā)展，這一點在其他學者的研究中也得到驗證。Hofstetter G[6]等認為p73通過不同啟動子轉(zhuǎn)錄，可產(chǎn)生TAp73和DNp73兩種不同的亞型，這兩種亞型在人類腫瘤細胞和腫瘤細胞株均有表達，TAp73與p53由于結(jié)構(gòu)方面的相似性，在抑癌、促細胞凋亡等方面具有相似功能；而DNp73結(jié)構(gòu)與p53有較大差異，表現(xiàn)出與p53不盡相同的功能，通過阻斷TAp73與p53的轉(zhuǎn)錄活性，對其誘導細胞凋亡產(chǎn)生負調(diào)控，具有抗細胞凋亡和致癌作用。同時Conforti等[7]研究發(fā)現(xiàn)DNp73是腫瘤中p73表達的主要形式，在腫瘤中的表達明顯增高，根據(jù)目前已知的DNp73具有抗細胞凋亡和致癌作用，考慮腎母細胞瘤中p73的表達亞型可能以DNp73為主。Daskalos等[8]利用MSP及實時熒光定量PCR方法對102例非小細胞型肺癌檢測p73基因p1、p2啟動子的甲基化狀態(tài)及p73亞型(TAp73、DNp73)mRNA的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：p1啟動子的高甲基化抑制了TAp73 mRNA的表達水平；p2啟動子的低甲基化與DNp73 mRNA的過表達密切相關(guān)，進一步證實抑癌基因(TAp73)高甲基化可導致基因沉默，癌基因(DNp73)低甲基化可致基因激活。Corn[9]等認為p73基因有復雜剪切變體(包括TAp73和DNp73)。長剪切變體起源于5'啟動子，即TAp73是CpG島內(nèi)啟動子轉(zhuǎn)錄，此啟動子的甲基化導致促凋亡TAp73基因沉默，同時可能允許保留抗凋亡基因DNp73的表達。而我們的實驗還將AML按照核型異常與否將AML分成兩組：KA-AML組和CN-AML組，然后將兩組患者的p73甲基化率進行比較，我們發(fā)現(xiàn)p73在KA-AML有更高的甲基化率(43%)。異常染色體核型通常和復雜細胞遺傳學有關(guān)而不僅僅是單個染色體的變化，還有表觀遺傳學異常等，KA-AML染色體變化的影響可能超過CN-AML表觀遺傳學基因沉默的生物學影響。Niemantsverdriet等[10]證實p73的高表達與患者較差的生存率密切相關(guān)，而我們將AML患者按照NCCN預后分組分成3個危險組，即低危組、中危組和高危組，檢測3組p73甲基化率，進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)3組間差異無統(tǒng)計學意義，提示p73甲基化不足以成為AML患者的獨立預后指標，需進一步研究。

總之，我們的研究表明p73甲基化在AML患者中較為常見，與疾病的發(fā)生發(fā)展可能相關(guān)，且與核型異常有關(guān)，為了給AML的特異性診療提供新的思路，有必要加大樣本進一步研究p73甲基化。

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(張愛國編輯)

讀者·作者·編者

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【通訊作者】李玉云。

【作者簡介】潘少君(1984-)，女，碩士，助教。研究方向：白血病、抑癌基因。

【基金項目】安徽省蚌埠醫(yī)學院自然科學研究項目(編號：BYKY1440)；安徽省高等學校省級自然科學研究項目(編號：Kj2012A198)。

[中圖分類號]R 551

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-2694(2016)01-008-4