小鼠皮下及肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型制備

宋天姣　曹倩文　王　娜　田　雨　鄭全輝

華北理工大學(xué)　河北唐山　063000；①河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

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小鼠皮下及肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型制備

宋天姣曹倩文王娜田雨鄭全輝①

華北理工大學(xué)河北唐山063000；①河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

[摘要]①目的經(jīng)皮下和尾靜脈注射，制備小鼠黑色素瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移模型。②方法體外培養(yǎng)黑色素瘤細(xì)胞，分別經(jīng)腋部皮下和尾靜脈注射接種C57BL/6小鼠，接種劑量分別為1×106/只和3×105/只，2周后觀察黑色素瘤形成及肺部轉(zhuǎn)移情況。③結(jié)果黑色素瘤細(xì)胞注射2周后，經(jīng)皮下接種的小鼠腋窩出現(xiàn)明顯腫瘤，成瘤率達(dá)100%;經(jīng)尾靜脈注射的小鼠肺部出現(xiàn)大量黑色素瘤結(jié)節(jié)， 腫瘤轉(zhuǎn)移率達(dá)90%。④結(jié)論經(jīng)皮下和尾靜脈注射方法能夠成功制備小鼠的腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移模型。

[關(guān)鍵詞]腫瘤細(xì)胞黑色素瘤增殖轉(zhuǎn)移

Preparation of subcutaneous and pulmonary metastasis mouse models

SONGTianjiao,CAOQianwen,WANGNa,etal

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

[ABSTRACT]ObjectiveTo prepare tumor proliferation and metastasis mouse models through subcutaneous and tail vein injection of melanoma cells.MethodsMelanoma cells(1×106/100uL)were subcutaneously injected into C57BL/6 mice from the axillary region to prepare the tumor proliferation mouse model;melanoma cells(3×105/100uL)were injected by tail vein to prepare the tumor metastasis mouse model.Melanoma tumor formation and lung metastasis were detected 2 weeks after melanoma cell injection.ResultsThe subcutaneously injected mice showed obvious melanoma formation in the axillary region and the tumor formation rate was 100%.The lung of tail vein injected mice showed apparent melanoma nodules and the tumor metastasis rate was 98%.ConclusionTumor proliferation and metastasis mouse models can be successfully prepared by subcutaneous and tail vein injection of melanoma cells.

[KEYWORDS]Tumor cell metastasis.Melanoma.Proliferation.Transfer

目前惡性腫瘤已成為一類嚴(yán)重威脅人類健康的多發(fā)病和常見病，其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，對腫瘤有效的治療措施還處在不斷探索之中。小鼠腫瘤模型在揭示腫瘤發(fā)病原因，探索發(fā)病機(jī)制以及評估治療措施中有著不可替代的作用[1]。本研究以體外培養(yǎng)的黑色素瘤B16細(xì)胞作為瘤種，采用皮下和尾靜脈注射方法建立腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移模型，以期為后續(xù)腫瘤免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制和治療研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株。小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所惠贈，在含10%胎牛血清及雙抗(青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL)的RPMI 1640(GIBCO公司)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，條件是飽和濕度、37℃、5%CO，2～3d更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞達(dá)到95% 融合時用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化、傳代培養(yǎng)。

1.1.2動物。C57BL/6 小鼠由中國食品藥品檢定研究院提供[許可證號：SCXK(京)2009-0017],SPF級環(huán)境培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1小鼠皮下黑色素瘤模型制備。消化、收集B16黑色素瘤，離心去上清，用無菌生理鹽水洗滌2次，將細(xì)胞懸浮于生理鹽水中，臺盼藍(lán)染色細(xì)胞活力大于95%，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL,對小鼠進(jìn)行皮下接種。①分組：取6～8周齡，雌性C57BL/6小鼠20只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)和對照組，每組10只；②接種：對小鼠腋下皮膚進(jìn)行酒精消毒，實(shí)驗(yàn)組小鼠注射B16細(xì)胞100μL/只(1×106)，對照組小鼠注射等量生理鹽水，2周后解剖小鼠觀察腫瘤生長情況。

1.2.2小鼠肺轉(zhuǎn)移黑色素瘤模型的制備。收集B16黑色素瘤細(xì)胞，用無菌生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106/mL。選取6～8周齡，雌性C57BL/6小鼠20只，分組同上。小鼠首先用紅外燈照射3～5min，待尾靜脈清晰可見后酒精消毒。實(shí)驗(yàn)組小鼠注射黑色素瘤細(xì)胞100μL(3×105)/只，對照組小鼠注射等量生理鹽水。2周后解剖小鼠觀察肺黑色素瘤轉(zhuǎn)移。

2結(jié)果

2.1B16黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)B16黑色素瘤細(xì)胞，當(dāng)其密度達(dá)到細(xì)胞瓶的95%時傳代、擴(kuò)增培養(yǎng)，直至細(xì)胞數(shù)量達(dá)到接種要求,見圖1。

圖1　B16黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)。放大倍數(shù)：40×

2.2皮下黑色素瘤小鼠制備實(shí)驗(yàn)組小鼠在皮下接種B16細(xì)胞7d后腋下開始出現(xiàn)可觸及的腫瘤，成瘤率達(dá)100% (10/10);2周后腫瘤明顯增大，幾乎累及整個小鼠的腋窩。解剖小鼠后可見明顯腫瘤團(tuán)塊形成，見圖2。

圖2　小鼠皮下黑色素瘤模型制備

2.3黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移小鼠制備B16細(xì)胞尾靜脈注射2周后處死小鼠，取肺組織觀察。實(shí)驗(yàn)組小鼠發(fā)生黑色素瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移率達(dá)90%(9/10)。由圖3可以看出，對照組小鼠肺臟成粉紅色，表面光滑；實(shí)驗(yàn)組小鼠肺臟蒼白，各個肺葉都長有大量黑色素瘤結(jié)節(jié)。

圖3　小鼠肺轉(zhuǎn)移黑色素瘤模型制備

3討論

腫瘤動物模型在研究人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，體內(nèi)觀察各種腫瘤治療效果以及探索新的腫瘤治療途徑方面發(fā)揮重要作用。在各類動物中，由于小鼠具有明確、穩(wěn)定的遺傳性狀，對腫瘤易感以及成本較低的優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。小鼠腫瘤模型按照建立方法可分為多種類型，如：基因修飾小鼠腫瘤模型，自發(fā)和誘發(fā)小鼠腫瘤模型以及移植小鼠腫瘤模型[2]。后者將移植抗原性與宿主相同的腫瘤細(xì)胞系接種于小鼠體內(nèi)，由于不存在或僅有很低的移植排斥反應(yīng)，因而腫瘤細(xì)胞能夠穩(wěn)定生長且生物性狀很少發(fā)生改變，故成為國內(nèi)外常用的腫瘤動物模型制備方法之一。

B16黑色素瘤細(xì)胞是來源于C57BL/6小鼠的自發(fā)性腫瘤細(xì)胞，同時也是為數(shù)不多產(chǎn)生色素的腫瘤細(xì)胞系之一[3]。B16細(xì)胞具備大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的共同特點(diǎn)如生長迅速，MHCⅠ類分子表達(dá)低易逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，侵襲性強(qiáng)易發(fā)生轉(zhuǎn)移等[4]。在本次實(shí)驗(yàn)中我們觀察到皮下注射B16細(xì)胞小鼠腫瘤形成快，成瘤率高，且成瘤率受細(xì)胞注射劑量的影響小?？蔀楹罄m(xù)腫瘤干預(yù)處理或腫瘤發(fā)展機(jī)理研究提供便利條件。

尾部靜脈注射是制備腫瘤轉(zhuǎn)移模型的常用方法, 我們預(yù)實(shí)驗(yàn)中嘗試不同劑量的B16細(xì)胞如1×105/只、3×105/只和1×106/只注射, 發(fā)現(xiàn)1×105/只劑量組肺轉(zhuǎn)移率低，約50%，可能與細(xì)胞數(shù)量少有關(guān)。而采用1×106/只注射，發(fā)現(xiàn)有些小鼠在注射完之后，出現(xiàn)痙攣，活動下降，隨后死亡，估計是形成癌栓，造成了肺栓塞的緣故[5]。因此，我們采用3×105/只注射，發(fā)現(xiàn)B16細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移率能夠達(dá)到90%，且肺部的黑色素瘤結(jié)節(jié)比較清晰，肉眼即可計數(shù)腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)目，對腫瘤轉(zhuǎn)移干預(yù)處理的后續(xù)研究提供了便利、可行的實(shí)驗(yàn)材料。

在此實(shí)驗(yàn)中，我們通過黑色素瘤B16細(xì)胞的皮下注射和尾靜脈注射建立了腫瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖和轉(zhuǎn)移的小鼠模型，且兩種腫瘤模型的制備操作簡便，成瘤率和轉(zhuǎn)移率高，實(shí)驗(yàn)周期短，為后續(xù)研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制以及探索腫瘤治療新途徑提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(張愛國編輯)

【通訊作者】鄭全輝。

【作者簡介】宋天姣(1994-)，女，本科生。研究方向：腫瘤免疫。

【基金項(xiàng)目】國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：8137311)；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：p013209019)；華北理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項(xiàng)目(編號：X2015153)。

[中圖分類號]Q 784

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]2095-2694(2016)01-001-2