48例兒童遺傳性耳聾基因GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA基因直接測序異常結(jié)果分析

段星娥 楊紅潤

【摘要】目的 分析云南省遺傳性耳聾分子基礎(chǔ)。方法 分析48例GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA直接測序法的異常結(jié)果。結(jié)果 GJB2基因發(fā)現(xiàn)4個(gè)突變位點(diǎn)，包括：79G>A、341A>G、109G>A和235delC，12sRNA發(fā)現(xiàn)三個(gè)突變位點(diǎn)，即：1382 A>C、1438A>G、1555A>G，SLC26A4和GJB3基因均未見突變； 突變頻率最高的突變位點(diǎn)是GJB2 79G>A和12sRNA 1438 A>G，其次是GJB2 341A>G。結(jié)論 GJB2和12sRNA基因可能是云南省最常見的致聾基因，兩個(gè)基因的熱點(diǎn)突變與國內(nèi)其它地方報(bào)道的有差異。

【關(guān)鍵詞】遺傳性耳聾；測序； GJB2； SLC26A4； GJB3； 12srRNA

【中圖分類號】R4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號】1671-8801（2016）01-0012-03

耳聾是人類常見的遺傳病之一，每1000個(gè)兒童里 1.3-2.3名兒童受耳聾困擾，超過50%的兒童期耳聾為遺傳性耳聾，在遺傳性耳聾中70%以上為非綜合征耳聾[1]。研究表明中國人的大部分非綜合征性耳聾由幾個(gè)主要基因的突變引起[2]， 如GJB2、SLC26A4、12srRNA，在此基礎(chǔ)上商業(yè)公司開發(fā)出了高通量的基因芯片法檢測。然而耳聾基因突變有一定的地域和種群差異，云南是中國少數(shù)民族最多的省份，有關(guān)耳聾基因突變的分子生物學(xué)研究報(bào)道較少，我們利用直接測序法篩選中國人常見的4個(gè)耳聾候選基因GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA對48例兒童非綜合性耳聾做了分析。

一、資料與方法

1.1.病例資料

48例聽力受損兒童均來自云南省內(nèi)各醫(yī)院耳鼻咽喉科門診病例，其中漢族16例，回族9，彝族8例，白族8例，納西族4，傣族1例，其它2例，年齡1-14歲，平均年齡5.3歲，男8例，女9例。所有病例通過病史調(diào)查（包括家族史、耳聾史及耳毒性藥物的使用情況等）和聽力學(xué)檢測證實(shí)為非綜合性耳聾。聽力損失程度根據(jù)純聽力圖，分別計(jì)算雙耳氣導(dǎo)0.5KHz、1 KHz、2 KHz、4 KHz處的平均聽閾，按WH O 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類： 聽力正常：≤25dBHL；輕度聽力損失： 26～40 dBHL；中度聽力損失： 41～70 dBHL； 重度聽力損失： 71 ～90 dBHL；極重度聽力損失： >90 dBHL。所有患者家長均簽署知情同意。

1.2.研究方法

1.2.1.試劑與儀器

血液基因組DNA提取試劑盒及2*pcr-mix均購自Tiangen公司，測序試劑Bigdye3.1為美國AB公司產(chǎn)品，定性PCR儀為BIO-RAD C1000 型； 凝膠掃描儀為UVP EC3Imaging System； 電泳儀為Bio-Rad產(chǎn)品；遺傳分析儀AB3500型。

1.2.2.利用primer5.0和oligo7.0設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1，引物經(jīng)上海生工合，Page純化。

1.2.3.標(biāo)本采集與基因組DNA提取

采集靜脈全血3ml，EDTA-K2抗凝，所有血樣用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為：PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2 2.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.75 μL，10pmol/μL引物各0.8μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板2 μL，加水至25 μL；PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 min；94℃20 s，57℃ 20 s，72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min；4℃保存。

1.2.5.DNA測序

PCR 產(chǎn)物4μL 在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外觀察為清晰明亮的目的擴(kuò)增條帶（無雜帶），擴(kuò)增片段用上、下游引物正反向分別測序。

二、研究結(jié)果

2.1測序結(jié)果突變類型

GJB2基因發(fā)現(xiàn)4個(gè)突變位點(diǎn)，包括：79G>A、341A>G、109G>A；12sRNA發(fā)現(xiàn)三個(gè)突變位點(diǎn)，即：1382 A>C、1438A>G、1555A>G，見圖1-5。SLC26A4和GJB3基因均未發(fā)現(xiàn)突變。

2.2. 突變基因型、臨床表型及突變頻率

48例測序發(fā)現(xiàn)最常見的突變12sRNA 1438 A>G，和GJB2基因79G>A，其突變頻率都達(dá)25.68%，其次是GJB2 341A>G，突變頻率為18.92%，發(fā)現(xiàn)1例GJB2 79G>A、341A>G和12sRNA 1438 A>G復(fù)合突變，見表2，3。

三、討論

隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和完成，耳聾致病基因的發(fā)現(xiàn)和克隆也取得了很大的進(jìn)展，遺傳性耳聾的致病基因及同一基因的突變位點(diǎn)在不同種族，甚至同一種族不同地區(qū)的人群中不盡相同，有很強(qiáng)的種族特異性。全國性耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查顯示我國感音神經(jīng)性聾患者由幾個(gè)主要基因主幾熱點(diǎn)突變引起，包括：GJB2基因（35delG、176del16、235delC、299delAT）、SLC26A4基因（2168A>G 、 IVS7-2A>G）、GJB3 基因（538C>T）以及12sRNA（1494C>T、1555A>G）等。我們設(shè)計(jì)合成的5對引物其PCR擴(kuò)增片段包含了以上4個(gè)基因的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)。GJB2 基因是最常見的致聾基因，高達(dá)21. 01%的耳聾患者攜帶該基因突變；其次是大前庭水管綜合征的責(zé)任基因SLC26A4 ，其在耳聾人群中的檢出率占15% 以上；另外，對氨基糖苷類抗生素異常敏感而至聾的12sRNA 1555A>G 和1494C>T檢出率分別3. 43% 和1. 03%。本文48例耳聾基因測序結(jié)果異常但臨床表型正常的有4例，為先證者的兄弟（或姐妹），實(shí)際臨床患有耳聾為42例，GJB2基因檢出率為69.05%（29/42）；12sRNA檢測出率為52.38%（12/22）。這和全國的調(diào)查結(jié)果有差異，這可能和云南特有民族結(jié)構(gòu)的分布有關(guān)，也有可能本文收集病例數(shù)較少，有些病例是同一個(gè)家系內(nèi)的樣本有關(guān)。

本文檢出的GJB2 79G>A和341 A>G導(dǎo)致編碼的第27 位和114位分別從纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岷凸劝彼徂D(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼幔M管有6例GJB2 79G>A和341 A>G臨床表現(xiàn)為正常，但它和其它耳聾基因突變組成復(fù)合突變時(shí)臨床表現(xiàn)中度或輕度聽力損失，表明攜帶GJB2 79G>A和341 A>G突變對遺傳性非綜合征性耳聾的發(fā)生具有密切的相關(guān)性，對于非綜合征性耳聾發(fā)病有較高風(fēng)險(xiǎn)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

本文發(fā)現(xiàn)的GJB2 109G>A，12sRNA 1382A>C國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道不明。GJB2 109G>A為突變雜合子，導(dǎo)致第37位纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，臨床上表現(xiàn)中度聽力損失，提示該位點(diǎn)突變?yōu)樵摬±年P(guān)鍵因素，可能是云南民族耳聾致病基因特有的突變位點(diǎn)，其致病機(jī)制需要更進(jìn)一步研究。12sRNA 1382A>C檢出2例突變，其中1例與12sRNA 1555A>G組合成復(fù)合突變，臨床上表現(xiàn)重度耳聾，2例均有氨基糖苷類抗生素用藥史，提示該位點(diǎn)亦是導(dǎo)致藥物性耳聾的作用靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] H V Toriello， W Reardon， R J Gorlin. Hereditary hearing loss and its syndromes[M]. Oxford University Press，2004. 67-69.

[2]戴樸，劉于飛，等。18 個(gè)省市聾校學(xué)生非綜合征性聾病分子流行病學(xué)研究-GJB2 235delC 和線粒體DNA 12SrRNA A1555G 突變篩查報(bào)告[J]。中華耳科學(xué)雜志，2006，1（4）：1-5。

[3]李琦，戴樸，黃德亮，等。SLC26A4 基因IVS7-2A>G 突變在中國不同地區(qū)和民族重度感音性聾患者中分布頻率的觀察[J]. 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007，42（12）：893-897.

[4] Reardon W. Genetic Deafness. J Med Genet. 1992， 29：521-526