一株抗汞真菌的分離純化及其對(duì)含汞廢水治理特性的研究*

趙盛開 張梅華 潘利祥 孫 璐 朱 彤,3 王昕竑 蔣繼宏 王立輝 姜朵朵 于 松

(1.中國(guó)石油大學(xué)(北京)化學(xué)工程學(xué)院，北京 102249；2.中節(jié)能集團(tuán)六合天融環(huán)?？萍加邢薰?，北京 100085；3.清華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系，北京 100084；4.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221116)

汞在常溫下呈液態(tài)，具有較強(qiáng)的毒性，是一種重要的工業(yè)原料，在有色金屬冶煉、造紙、電子工業(yè)、農(nóng)藥生產(chǎn)等諸多領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。每年有大量的汞污染物以廢水、廢氣、廢渣的形式進(jìn)入水體、大氣及土壤中，排入環(huán)境中的汞污染物經(jīng)過物理化學(xué)及生物作用形成各種形態(tài)的汞。汞污染物難以用一般的生化方法進(jìn)行降解處理，因此可在自然環(huán)境中長(zhǎng)期存在，并通過食物鏈等方式進(jìn)入生物體內(nèi)，危及人類健康[1]。

目前，工業(yè)廢水除汞的方法主要有化學(xué)沉淀法、金屬還原法、活性炭吸附法、電解法、離子交換法和微生物法等[2-4]。其中，微生物法因成本低、生物污泥產(chǎn)量少、操作pH及溫度范圍寬、吸附性及選擇性高等成為最具發(fā)展前景的含汞廢水處理方法，特別在處理Hg2+質(zhì)量濃度為1～100 mg/L的含汞廢水時(shí)表現(xiàn)出良好的處理效果[5]。陳宏偉[6]利用從污染物中分離出的假單胞菌(Pseudomonassp.)處理Hg2+質(zhì)量濃度為30 mg/L的含汞廢水，24 h后Hg2+的去除率高達(dá)91.7%。WAGNER D?BLER等[7]利用7種耐汞假單胞菌，在700 L的生物反應(yīng)器中處理電解廢水(Hg2+質(zhì)量濃度為3～10 mg/L)，10 h后Hg2+的去除率可以達(dá)到95%～99%。SHARIAT等[8]利用產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)處理2.5 mg/L的甲基汞溶液，24 h后甲基汞的去除率達(dá)到60%。此外，還有學(xué)者利用基因工程菌[9-10]、混合菌[11]等處理含汞廢水。

本研究從被汞污染的土壤中分離篩選出抗汞真菌，通過內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列比對(duì)進(jìn)行菌株的系統(tǒng)分類鑒定，并對(duì)其處理含汞廢水的特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

在重慶萬山地區(qū)受汞礦污染的表層土(0～10 cm)中采集土壤樣品用于分離抗汞真菌。

1.2 菌種篩選及分離純化

將采集的土壤樣品用采樣袋密封保存帶回實(shí)驗(yàn)室。取10 g新鮮土壤樣品裝入含有90 mL無菌水的三角瓶中，用玻璃珠打散攪勻，制成土壤懸液。將懸液涂布在含Hg2+20.00 mg/L的AY固體培養(yǎng)基(無水醋酸鈉0.246 1 g/L，酵母提取物0.15 g/L，瓊脂15 g/L，氯霉素25 mg/L，pH=7)平板[12-13]上，室溫條件培養(yǎng)，觀察真菌菌株的生長(zhǎng)情況。挑選單個(gè)真菌菌株接入新鮮的含Hg2+20.00 mg/L的AY固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化。

1.3 菌懸液制備

將上述分離純化的菌株接種至擴(kuò)大液體培養(yǎng)基(葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaCl20.1 g/L，KCl 0.1 g/L,MgSO40.25 g/L,FeSO40.005 g/L，pH=7)[14]中，在25 ℃、130 r/min下?lián)u床培養(yǎng)3 d，然后在11 000 r/min下離心5 min,取離心后的菌液作為生物吸附菌懸液，4 ℃下保藏備用。

1.4 菌種鑒定

采用真菌基因組提取試劑盒提取菌株的DNA，利用真菌通用引物ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTG ATATGC)進(jìn)行ITS rRNA基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。溫度程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)加熱3 min，然后在95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物直接用于堿基序列測(cè)定。利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站的BLAST進(jìn)行堿基序列的比對(duì)，確定菌株的系統(tǒng)分類。

1.5 影響因素分析

由于反應(yīng)時(shí)間、Hg2+初始濃度、pH、菌劑投加量對(duì)Hg2+的生物吸附有較大影響，配置HgCl2溶液50 mL，對(duì)每個(gè)影響因素均設(shè)置5組梯度實(shí)驗(yàn)，在25 ℃、180 r/min下振蕩反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后靜置12 h，測(cè)定每組溶液中Hg2+含量，計(jì)算Hg2+的去除率。

1.6 菌株的微觀表征

配制兩份100 mL的AY液體培養(yǎng)基(其他配方與AY固體培養(yǎng)基相同，不含瓊脂)，其中一份培養(yǎng)基中含Hg2+20.00 mg/L，另一份不含Hg2+，將分離出的菌株接種到兩份AY液體培養(yǎng)基中，室溫條件下靜置培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)基中混合物于11 000 r/min下離心5 min，收集沉淀物(即濕菌體)。將濕菌體清洗、固定、脫水、干燥、黏托、表面金屬鍍膜等處理后，進(jìn)行掃描電鏡觀察，研究菌體吸附Hg2+前后的形態(tài)變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離菌株的系統(tǒng)分類

經(jīng)分離、擴(kuò)大培養(yǎng)、馴化、篩選后，從受汞礦污染的土壤樣品中分離得到一株對(duì)Hg2+具有較強(qiáng)耐受性的真菌菌株，命名為GX-4。通過ITS序列比對(duì)，對(duì)GX-4進(jìn)行了系統(tǒng)分類鑒定，發(fā)現(xiàn)GX-4與尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)同源性達(dá)到99%，屬半知菌類，從梗孢目，瘤座孢科，鐮刀菌屬。尖孢鐮刀菌對(duì)重金屬廢水具有較好的吸附去除效果，VELMURUGAN等[15]利用鐮刀菌(Fusariumspp.)治理含Zn2+廢水，Zn2+去除率達(dá)到30%～60%；SU等[16]利用FusariumoxysporumCZ-8F1治理含砷廢水，也取得了良好的效果。

2.2 反應(yīng)時(shí)間的影響

制備5組Hg2+初始質(zhì)量濃度為20.00 mg/L的HgCl2溶液50 mL，調(diào)節(jié)溶液pH為5，向每組溶液中投加2.0 g GX-4菌懸液，反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)定為30、60、120、240、360 min，考察不同反應(yīng)時(shí)間下GX-4對(duì)Hg2+的吸附去除效果，結(jié)果見圖1。

由圖1可見，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從30 min延長(zhǎng)到60 min時(shí)，Hg2+的去除率顯著提高，反應(yīng)60 min時(shí)，Hg2+的去除率即可達(dá)到93.14%，隨著反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，Hg2+的去除率提高緩慢，反應(yīng)進(jìn)行360min后，Hg2+的去除率僅提高到94.90%。OZSOY[17]利用寡孢根霉菌(Rhizopusoligosporus)及WU等[18]利用黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporim)處理含汞廢水時(shí)也發(fā)現(xiàn)了相似的變化趨勢(shì)?？梢?，微生物對(duì)Hg2+的吸附去除主要經(jīng)歷兩個(gè)階段：第1階段是快速的表面吸附階段；第2階段是緩慢的胞內(nèi)擴(kuò)散階段[19]。真菌對(duì)Hg2+表現(xiàn)出良好的吸附去除效果，這是因?yàn)檎婢?xì)胞壁上存在一系列的功能基團(tuán)，如氨基基團(tuán)、羧基基團(tuán)、磷酸鹽基團(tuán)等,這些基團(tuán)能夠提供負(fù)電荷成為Hg2+的有效靶位點(diǎn)[20-21]，被吸附在這些靶位點(diǎn)上的Hg2+與配合物以及電子相互交換，經(jīng)過一段時(shí)間后，Hg2+通過被還原或者被固定從而有效去除。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)Hg2+去除率的影響

2.3 Hg2+初始濃度的影響

配置5組HgCl2溶液50 mL，調(diào)節(jié)溶液中Hg2+初始質(zhì)量濃度分別為0.50、5.00、10.00、20.00、50.00 mg/L，溶液pH為5，向每組溶液中投加2.0 g GX-4菌懸液，振蕩反應(yīng)360 min，考察Hg2+初始質(zhì)量濃度對(duì)Hg2+去除率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 Hg2+初始質(zhì)量濃度對(duì)Hg2+去除率的影響

由圖2可見，隨著Hg2+初始濃度的增加，Hg2+去除率呈現(xiàn)出較大的波動(dòng)變化，這是因?yàn)檎婢?xì)胞壁上的靶位點(diǎn)數(shù)相對(duì)固定，當(dāng)Hg2+初始質(zhì)量濃度小于10.00 mg/L時(shí)，這些靶位點(diǎn)沒有被充分激活，此時(shí)Hg2+去除率隨著Hg2+初始濃度的增加而降低；當(dāng)Hg2+初始質(zhì)量濃度為10.00～20.00 mg/L時(shí)，細(xì)胞壁上的靶位點(diǎn)被逐漸激活，Hg2+去除效率隨著Hg2+初始濃度的增加而升高；由于菌劑投加量有限，當(dāng)Hg2+初始質(zhì)量濃度超過20.00 mg/L時(shí)，沒有足夠的靶位點(diǎn)吸附Hg2+[22]，去除率又開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)Hg2+初始質(zhì)量濃度為0.50 mg/L時(shí)，Hg2+去除率高達(dá)94.80%，出水Hg2+降至0.03 mg/L以下，滿足《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 8978—1996)的限值要求(<0.05 mg/L)[23]。因此，對(duì)于Hg2+初始質(zhì)量濃度超過0.50 mg/L的含汞廢水可以采用多級(jí)處理方式，以滿足廢水達(dá)標(biāo)排放的要求。

2.4 pH的影響

制備5組Hg2+初始質(zhì)量濃度為20.00 mg/L的HgCl2溶液50 mL，調(diào)節(jié)溶液pH分別為3、4、5、6、7，向每組溶液中投加2.0 g GX-4菌懸液，反應(yīng)360 min，考察不同pH下GX-4對(duì)Hg2+的吸附去除效果，結(jié)果見圖3。

圖3 pH對(duì)Hg2+去除率的影響

由圖3可見，pH可以顯著影響GX-4對(duì)Hg2+的吸附去除效果，這是因?yàn)閜H能夠影響金屬離子的化學(xué)形態(tài)，調(diào)整溶液中氫離子的濃度，進(jìn)而改變真菌細(xì)胞壁上靶位點(diǎn)的化學(xué)性質(zhì)，影響Hg2+的去除率[24]。當(dāng)溶液pH為5時(shí)，Hg2+的去除率最高，為95.35%，可能是低pH條件下真菌細(xì)胞壁上靶位點(diǎn)的質(zhì)子化作用阻止了其對(duì)重金屬的吸附，隨著pH的增加，去質(zhì)子化作用使得靶位點(diǎn)上的負(fù)電荷增多，從而更容易吸附Hg2+ [25]。DAS等[26]也研究了pH對(duì)Hg2+去除率的影響，認(rèn)為真菌處理含汞廢水中的最適pH為5～7。

2.5 GX-4菌懸液投加量的影響

制備5組Hg2+初始質(zhì)量濃度為20.00 mg/L的HgCl2溶液50 mL，調(diào)節(jié)溶液pH為5，向溶液中分別投加0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 g GX-4菌懸液，振蕩反應(yīng)360 min，考察不同投加量下GX-4對(duì)Hg2+的吸附去除效果，結(jié)果見圖4。

圖4 GX-4菌懸液投加量對(duì)Hg2+去除率的影響

由圖4可見，當(dāng)GX-4菌懸液投加量為0.5～1.0 g時(shí)，Hg2+的去除率顯著提高，當(dāng)GX-4菌懸液投加量為1.0 g時(shí)，Hg2+去除率最大，為94.55%。這是因?yàn)殡S著GX-4菌懸液投加量的增加，真菌細(xì)胞壁上提供的靶位點(diǎn)總數(shù)增加，更多的Hg2+被吸附，使Hg2+去除率迅速增加。當(dāng)GX-4菌懸液投加量為2.0～5.0 g時(shí)，Hg2+去除率明顯下降，繼續(xù)增加GX-4菌懸液投加量至10.0 g時(shí)，Hg2+去除率基本穩(wěn)定在91%左右?？梢?，GX-4菌懸液的最佳投加量在1.0～2.0 g。分析原因，可能是過多的菌劑可能阻礙了靶位點(diǎn)的暴露，反而不利于真菌對(duì)Hg2+的吸附去除[27]。

2.6 GX-4的微觀表征

吸附Hg2+前后GX-4菌體的微觀形態(tài)變化見圖5。由圖5(a)可見，在不含Hg2+的AY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后，GX-4菌體表面較為光滑，而在含Hg2+的AY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后，菌體表面較為粗糙，有顆粒附著，這與胡曉婧等[28]利用平菇菌糠吸附廢水中Cu2+的掃描電鏡結(jié)果類似。經(jīng)檢測(cè)，圖5(b)中GX-4菌體表面的顆粒狀物體為Hg2+離子，進(jìn)一步證明了GX-4可以有效吸附Hg2+的表面特性。此外，菌體周圍有明顯的沉淀物，推斷GX-4在含汞條件下產(chǎn)生某類生物酶，催化Hg2+發(fā)生沉淀反應(yīng)，從而固定Hg2+[29]。

圖5 吸附Hg2+前后GX-4的微觀形態(tài)

3 結(jié)論和建議

從汞污染土壤中分離純化出一株抗汞真菌菌株GX-4，經(jīng)基因測(cè)序鑒定，該菌屬于尖孢鐮刀菌。利用GX-4處理含汞廢水，發(fā)現(xiàn)30～60 min為GX-4對(duì)Hg2+的快速吸附階段，在處理Hg2+初始質(zhì)量濃度低于0.50 mg/L的含汞廢水時(shí)，出水Hg2+能夠達(dá)到GB 8978—1996的排放限值要求；GX-4菌懸液的最佳投加量為1.0～2.0 g，最佳反應(yīng)pH為5。

對(duì)吸附Hg2+后的GX-4進(jìn)行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)該菌能將吸附的Hg2+轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的沉淀物。利用真菌治理重金屬污染的微生物技術(shù)具有綠色環(huán)保、無二次污染、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，本研究發(fā)現(xiàn)的抗汞真菌菌株可用作生物反應(yīng)器的活性組分，未來具有廣闊的應(yīng)用前景。

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