細(xì)菌介導(dǎo)的腫瘤治療研究進展

柳賢德，姜圣男

(1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)專業(yè)，海南?？?570228；2.?？谑腥嗣襻t(yī)院核醫(yī)學(xué)科，海南?？?570208)

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細(xì)菌介導(dǎo)的腫瘤治療研究進展

柳賢德1，姜圣男2*

(1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)專業(yè)，海南海口 570228；2.海口市人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，海南海口 570208)

雖然針對腫瘤治療的化學(xué)合成藥物、天然提取物、基因工程藥物和靶向性藥物得到了快速發(fā)展，但還達(dá)不到治療腫瘤的效果。一些細(xì)菌，尤其是厭氧或兼性厭氧菌可在腫瘤組織內(nèi)定殖，而且有效抑制腫瘤的生長。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們改造了一系列厭氧或兼性厭氧菌，降低其毒性的同時，利用腫瘤靶向定殖的能力，使之作為攜帶治療分子的載體，為腫瘤治療提供了新的方向。如果細(xì)菌介導(dǎo)腫瘤治療，以寵物臨床應(yīng)用為目的，做進一步深入研究，可為寵物腫瘤提供更理想的治療方案。

細(xì)菌；腫瘤；寵物臨床

腫瘤是當(dāng)今難以治愈，危害人和動物健康及生命的重要疾病。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法主要有手術(shù)、放療和化療。腫瘤治療過程中，手術(shù)療法很難完全清除腫瘤細(xì)胞，作為有效的輔助療法，放射療法和化學(xué)療法成為了腫瘤治療學(xué)的支柱。但是，很多病例中不管是放療，還是化療，都很難完全殺死腫瘤細(xì)胞，而且還可能引發(fā)細(xì)胞毒性、腫瘤細(xì)胞耐藥性、機體免疫力低下等問題。這主要是因為放療和化療的藥物達(dá)不到腫瘤的缺氧區(qū)域而引起的。低氧區(qū)域的存在是實體瘤的一大特性，這是由于伴隨著腫瘤的生長，會刺激腫瘤內(nèi)新血管的產(chǎn)生。腫瘤中混亂的新成血管分布，未完全發(fā)育的血管內(nèi)皮，不完善的封閉段，紊亂的血液循環(huán)等因素，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)血液流動緩慢而致使腫瘤組織內(nèi)氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)傳遞低效，從而形成了一個低氧(氧含量小于10 mL/L或0～2.66 kPa,正常組織氧含量約為30 mL/L～50 mL/L，2.66 kPa～13.3 kPa)或缺氧的區(qū)域，而且處于低氧的腫瘤細(xì)胞會促進其向惡性或轉(zhuǎn)移的方向發(fā)展。放療過程中，氧具有極其重要的決定性作用，處于低氧的細(xì)胞對電離輻射的抵抗率是正常細(xì)胞的3倍以上；化療過程中，因腫瘤內(nèi)血管分布紊亂和化療藥物的傳遞低效，導(dǎo)致耐藥性腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生[1-2]。因此，適合在缺氧區(qū)域定殖的細(xì)菌作為載體的靶向腫瘤治療方法，越來越受到很多研究者的關(guān)注[3-4]。本文將對細(xì)菌介導(dǎo)腫瘤治療進行系統(tǒng)的闡述，為其應(yīng)用在犬腫瘤治療上提供參考。

1　細(xì)菌介導(dǎo)腫瘤治療

多年以前，人們就已經(jīng)開始嘗試用細(xì)菌進行腫瘤治療，Coley W B發(fā)現(xiàn)，癌癥病人手術(shù)后如果感染了細(xì)菌，其治愈率有所提高；且目前臨床上手術(shù)摘除膀胱癌后，常會注射一種預(yù)防肺結(jié)核的疫苗BCG，以降低復(fù)發(fā)率[5]。細(xì)菌抑制腫瘤生長的主要機制并不明確，但也有相應(yīng)的幾種解釋：①細(xì)菌消耗了腫瘤生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，如其產(chǎn)生的天冬酰胺酶能夠分解腫瘤生長的必需氨基酸；②細(xì)菌能夠產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)以及分泌局部毒素，破壞或抑制腫瘤正常血管的形成[6-7]；③在細(xì)菌的定殖區(qū)域，其非特異性炎癥反應(yīng)可促使免疫系統(tǒng)潛在激活抗腫瘤T細(xì)胞[8]。

細(xì)菌具有很多優(yōu)勢，使其作為“完美的載體”很好地應(yīng)用于抗癌治療：①細(xì)菌像小型“機器人”，可攜帶成像探針特異性靶標(biāo)到腫瘤細(xì)胞，為我們提供有關(guān)腫瘤狀態(tài)、定位的成功率以及治療效果等精確信息[9]；②細(xì)菌可攜帶抗腫瘤藥物靶標(biāo)到腫瘤細(xì)胞，而且分散于整個腫瘤組織并有很強的逆行腫瘤的能力，可大大提高治療性分子的傳遞效率[10]；③細(xì)菌對腫瘤的特異性靶向作用，提高治療效率及減少對正常組織的損害。

1.1細(xì)菌的腫瘤靶向

細(xì)菌之所以能成為一種新的抗腫瘤治療策略的載體，靶向腫瘤并且可定殖于腫瘤的低氧區(qū)域有著密不可分的關(guān)系。細(xì)菌靶向腫瘤的機理也不明確，但也有相應(yīng)的幾種解釋[11]：①由于腫瘤中紊亂的血管系統(tǒng)造成氧及營養(yǎng)物質(zhì)傳遞低效，這為厭氧菌或兼性厭氧菌的定殖提供了有利條件；②在低氧的環(huán)境下，腫瘤部位分泌的腫瘤生長因子β(TGF-β)可以抑制中性粒細(xì)胞的激活和浸潤，使巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的殺菌活性受損；③由于腫瘤內(nèi)部氧含量低且間質(zhì)壓大，細(xì)菌不容易暴露在抗體下，在一定程度上逃避小鼠免疫系統(tǒng)。

1.2腫瘤治療用細(xì)菌載體

目前發(fā)現(xiàn)有多種細(xì)菌可應(yīng)用于抗腫瘤治療，如雙歧桿菌(Bifidobacterium),梭菌(Clostridum)及沙門菌(Salmonella)等。相比外圍的腫瘤增生組織，兼性厭氧菌(如減毒沙門菌和大腸埃希菌)更傾向定殖于低氧和壞死區(qū)域，而且對實體腫瘤的低氧區(qū)域進行準(zhǔn)確的靶向定位[12-14]。

1.2.1大腸埃希菌大腸埃希菌屬非厭氧益生菌，易于培養(yǎng)和體外基因操作，被廣泛用于體外基因表達(dá)的載體。由于大腸埃希菌為正常菌群，且主要在盲腸及結(jié)腸生長，其作為消化道腫瘤基因治療載體的潛力受到廣泛關(guān)注[15]。大腸埃希菌Nissle1917的腫瘤靶向性最高，它能在小鼠的腫瘤部位聚集，且不被免疫系統(tǒng)清楚，而且可攜帶外來基因(如GFP)，不影響消化道中的黏附及定殖。大腸埃希菌Nissle1917通過口服可治療腹瀉、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩腸炎等消化道疾病，顯示其安全性和有效性，證明了治療腫瘤用作治療載體的可行性[16-18]。Jiang S N等[6]利用大腸埃希菌MG1655作為腫瘤治療載體并攜帶治療性分子細(xì)胞溶素蛋白(ClyA，是一種在大腸埃希菌、傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌中被發(fā)現(xiàn)的34 kb大小的成孔溶血蛋白，它通過組裝成環(huán)形毒素低聚物以在細(xì)胞膜表面形成穩(wěn)定的孔洞)通過尾靜脈注射到小鼠結(jié)腸癌模型。大腸埃希菌MG1655- ClyA顯著抑制腫瘤的生長，而且與放療協(xié)同治療時，腫瘤部分或完全根除。

1.2.2沙門菌1997年，耶魯大學(xué)的Pawelek J M等[19]首次系統(tǒng)地研究了減毒沙門菌的直接抗瘤活性及其作為靶向治療載體的可能性，發(fā)現(xiàn)高侵襲力、營養(yǎng)缺陷型沙門菌具有直接的抗腫瘤活性，并具有靶向治療載體的很多優(yōu)點。減毒鼠傷寒沙門菌VNP20009注射到多種移植瘤小鼠模型(鼠結(jié)腸癌、鼠乳腺癌、鼠肺癌、人黑色素瘤、人結(jié)腸癌)，發(fā)現(xiàn)具有良好的靶向性，而且動物的生存時間也得到了延長。利用猴子觀察了該菌的分布情況，發(fā)現(xiàn)主要分布在肝、脾、淋巴結(jié)、骨髓等組織中，30 d后只有肝能檢測到細(xì)菌[20-21]。缺少鳥嘌呤核苷5′-二磷酸-3′-二磷酸鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium， ΔppGpp)也是減毒沙門菌。Jiang S N等[9]將攜帶ClyA的沙門菌ΔppGpp注射到移植瘤小鼠模型(鼠結(jié)腸癌和肝癌模型)，有效抑制腫瘤的生長，并且延長了動物的生存時間。沙門菌ΔppGpp在小鼠的肺、肝、腦膠質(zhì)瘤等腫瘤模型中都表現(xiàn)出很好的腫瘤抑制效果[22-25]。

1.3細(xì)菌介導(dǎo)腫瘤治療存在的問題

細(xì)菌介導(dǎo)的腫瘤治療中，細(xì)菌大部分聚集在腫瘤壞死區(qū)域，而且宿主的中性粒細(xì)胞移入到活腫瘤細(xì)胞，像屏障一樣包圍了腫瘤壞死區(qū)域并把腫瘤壞死區(qū)域和活腫瘤細(xì)胞區(qū)域分開，細(xì)菌感染而引發(fā)的腫瘤壞死區(qū)域越大，中性粒細(xì)胞的浸潤更強。利用抗體消耗小鼠的中性粒細(xì)胞，細(xì)菌誘導(dǎo)的腫瘤壞死區(qū)域顯著增大，而且腫瘤中的細(xì)菌數(shù)量也相應(yīng)提高[26]。沙門菌ΔppGpp介導(dǎo)的抑制腫瘤生長階段，沙門菌ΔppGpp在腫瘤中引發(fā)IL-1β/TNF-α介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，巨噬細(xì)胞主要分泌TNF-α，樹突狀細(xì)胞主要分泌IL-1β[27]，而且TNF-α和IL-1β對抑制腫瘤生長有著積極的作用。系統(tǒng)性的中細(xì)粒細(xì)胞消耗在臨床治療中是不切實際的，但如果通過細(xì)菌的靶向抑制腫瘤組織中性粒細(xì)胞的募集，一定能提高細(xì)菌的腫瘤治療效果。

2　犬腫瘤臨床治療

在獸醫(yī)領(lǐng)域，犬是最易患腫瘤的動物。小動物臨床腫瘤的發(fā)病率正逐年增多，也是動物死亡的主要病因之一。腫瘤可能會侵襲到動物身體的多個器官和組織。犬腫瘤發(fā)生過程中，品種、年齡、性別、遺傳基因、環(huán)境等因素與腫瘤的發(fā)生有密切相關(guān)。犬乳腺腫瘤多發(fā)于母犬，而公犬少見；多見于老齡犬，少見于幼齡犬。隨著城市污染的加劇，有些腫瘤疾病如鼻咽部腫瘤發(fā)生的幾率城市犬高于鄉(xiāng)村犬[28]。劉春暉等[29]調(diào)查了北京地區(qū)犬腫瘤發(fā)生情況，前3位的腫瘤依次是乳腺腫瘤、皮膚腫瘤、肛周瘤、睪丸腫瘤、陰道腫瘤；在發(fā)病率前5位的腫瘤中，排名前3位的品種中都有京巴犬；患腫瘤犬的平均年齡為9.36±3.74，除皮膚腫瘤其余4種腫瘤的發(fā)病年齡均大于10歲。朱國等[30]調(diào)查了杭州地區(qū)犬腫瘤發(fā)生情況，乳腺和皮膚及軟組織是犬腫瘤臨床高發(fā)的部位；京巴犬、雜交犬、貴賓犬是腫瘤高發(fā)品種；平均年齡9.39歲，6歲～10歲發(fā)病率最高。

2.1手術(shù)療法

對于犬腫瘤治療，目前最常用最有效地方法依舊是手術(shù)摘除。手術(shù)的成功很大程度上取決于動物的身體機能狀況及診斷處于早期還是晚期。但是手術(shù)切除不徹底，可引起繼發(fā)感染或腫瘤擴散等風(fēng)險。

2.2化學(xué)療法

化學(xué)療法是一種化學(xué)藥物殺死腫瘤細(xì)胞的過程，干擾腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過程，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，達(dá)到殺傷腫瘤的目的。但是化療藥物存在毒性較大、損傷機體免疫系統(tǒng)等風(fēng)險。

2.3放射療法

放射療法是用放射線殺滅腫瘤細(xì)胞的方法，其多用于對局限性的病灶進行治療，用于神經(jīng)組織、軟組織、圓形細(xì)胞腫瘤等，但也存在傷害機體免疫系統(tǒng)等風(fēng)險。放射療法在犬腫瘤方面的應(yīng)用有限，但手術(shù)后的補助治療手段，前景甚好。

2.4細(xì)菌療法

2005年Douglas及其同事進行了沙門菌VNP20009治療犬自發(fā)性腫瘤的Ⅰ期臨床試驗，沙門菌VNP20009對部分犬具有抗腫瘤作用，但會產(chǎn)生發(fā)熱、腹瀉和嘔吐等不良反應(yīng)，呈現(xiàn)劑量依賴性毒性作用。Dang L H等[31]也利用諾維梭菌對16例自發(fā)性軟組織肉瘤犬進行了治療，有一定的治療效果，但也伴隨著不良反應(yīng)如發(fā)熱、炎癥、膿腫、食欲不振和嗜睡等。治療犬自發(fā)性腫瘤一般采用靜脈注射或瘤內(nèi)注射的方式，致病和弱毒菌株都呈現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng)[32-33]。因此，選擇何種菌株來減少細(xì)菌療法的毒副作用，而且適用于那些腫瘤以及細(xì)菌與腫瘤環(huán)境之間的相關(guān)關(guān)系和所涉及的機理等問題，需要進一步研究和闡明。

3　展望

癌癥是極其復(fù)雜和存在很多未知的疾病，雖然現(xiàn)今有很多治療方法，但對癌癥還是束手無策。盡管在獸醫(yī)領(lǐng)域?qū)θ橄倌[瘤的各種治療方法還存在爭議，但進行外科手術(shù)幾乎是所有患有乳腺腫瘤犬所采取的治療方法。可能發(fā)展成為轉(zhuǎn)移性的犬乳腺腫瘤病例，還可增加化學(xué)療法、激素療法、放射療法、中醫(yī)療法等綜合治療進行控制。細(xì)菌治療腫瘤的歷史已有100多年，隨著微生物基因工程技術(shù)的發(fā)展和研究方法的不斷改善，治療效果和安全性也明顯改善。作者正在進行沙門菌ΔppGpp攜帶各種治療分子治療腫瘤的相關(guān)研究，最終目標(biāo)是將其應(yīng)用在寵物的臨床腫瘤治療。研究的初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)，屬傷寒沙門菌ΔppGpp在3×107CFU/kg～3×109CFU/kg范圍內(nèi)，對犬不會產(chǎn)生不良反應(yīng)，而且對腫瘤細(xì)胞活性具有明顯的抑制作用。細(xì)菌靶向腫瘤治療具有對正常組織的損傷小、價格便宜、操作簡便等優(yōu)勢，如果能應(yīng)用在國內(nèi)城市高發(fā)的犬乳腺和皮膚腫瘤的治療，可為寵物腫瘤的臨床治療提供新的思路。細(xì)菌靶向腫瘤治療應(yīng)用在寵物臨床，需要更多的科學(xué)研究和臨床試驗，確保細(xì)菌治療寵物腫瘤的有效性和安全性。

[1]卓越，劉陳立.腫瘤細(xì)菌療法綜述[J].集成技術(shù),2015,4(4):10-16.

[2]哈小琴，張尚弟，楊志華，等.腫瘤生物治療的新技術(shù)-靶向基因治療[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2014,26(7):24-27.

[3]鄒雅如，陳麗華，伍勇.細(xì)菌在惡性腫瘤防治中的作用[J].中華臨床實驗室管理電子雜志，2014,2(3):152-157.

[4]趙文鉞，劉璐，劉福囡.雙歧桿菌在腫瘤基因靶向治療的應(yīng)用[J].解剖科學(xué)進展，2015,21(4):405-407.

[5]Nguyen V H,Min J J.Visualization of anticancerSalmonellatyphimuriumengineered for remote control of therapeutic proteins [J].Meth Mol Biol,2016,1409:135-142.

[6]Jiang S N,Phan T X,Nam T K,et al.Inhibition of tumor growth and metastasis by a combination ofEscherichiacolimediated cytolytic therapy and Radiotherapy [J].Mol Thera,2010,18(3):635-642.

[7]Uthman S,Zheng S,Han J,et al.Preparation of engineered salmonella typhimurium drivern hyaluronic acid based microbeads with both chemotactic and biological targeting towards breast cancer cell for enhanced anticancer therapy [J].Adv Health Material,2016,5(2):288-295.

[8]Min J J,Kim H J,Park J H,et al.Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emittingEscherichiacoli[J].Mol Imag Biol,2008,10(1):54-61.

[9]Jiang S N,Park S H,Lee H J,et al.Engineering of bacteria for the visualization of targeted delivery of a cytolytic anticancer agent [J].Mol Thera,2013,21(11):1985-1995.

[10]Phan T X,Nguyen V H,Duong M T,et al.Activation of inflammasome by attenuatedSalmonellatyphimuriumin bacteria mediated cancer therapy [J].Microbiol Immunol,2015,59(11):664-675.

[11]Neil S F.Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy [J].Nat Rev，2010，11(10)：785-794.

[12]Harrison L B,Chadha M,Hill R J,et al.Impact of tumor hypoxia and anemia on radiation therapy outcomes [J].Oncologist,2002,7(6):492-508.

[13]Wachsberger P,Burd R,Dicker A P.Tumor response to ionizing radiation combined with antiangiogenesis or vascular targeting agents:exploring mechanisms of interaction [J].Clin Cancer Res,2003,9(6):1957-1971.

[14]Pawelek J M,Low K B,Bermudes D.Bacteria as tumour-targeting vectors [J].Lancet Oncol,2003,4(9):548-556.

[15]蔡惠，鄭有禮，王健生.細(xì)菌載體在腫瘤治療中的應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代普通外科進展,2010，13(1)：63-67.

[16]Stritzker J,Weibel S,Hill P J,et al.Tumor-specific colonization, tissue distribution,and gene Induction by probioticEscherichiacoliNissle1917in live mice [J].Int J Med Microbiol,2007,297(3):151-162.

[17]Schultz M,Watzl S,Oelschlaeger T A,et al.Green fluorescent protein for detection of the probiotic microorganismEscherichiacolistrain Nissle 1917 (EcN)invivo[J].J Microbiol Meth,2005,61(3):389-398.

[18]Lasaro M A,Salinger N,Zhang J,et al.F1C fimbriae play an important role in biofilm formation and intestinal colonization by theEscherichiacolicommensal strain Nissle 1917 [J].Appl Environ Microbiol,2009,75(1):246-251.

[19]Pawelek J M,Low K B,Bermudes D.Tumor-targetedSamonellaas a novel anticancer vector[J].Cancer Res,1997,57(20):4537-4544.

[20]Zheng L M ,Luo X,Feng M,et al.Tumor amplified protein expression therapy:Salmonellaas a tumor-selective protein delivery vector [J].Oncol Res,2000,12(3):127-135.

[21]Luo X,Li Z,Lin S,et al.Antitumor effect of VNP20009,an attenuatedSalmonella,in murine tumor models[J].Oncol Res,2001,12(11):501-508.

[22]Rosenberg S A,Spiess P J,Kleiner D E.Antitumor effects in mice of the intravenous inject ion of attenuatedSalmonellatyphimurium[J].J Immunother,2002,25(3):218-225.

[23]Jeong J H,Kim K,Lim D,et al.Anti-tumoral effect of the mitochondrial target domain of noxa delivered by an engineeredSalmonellatyphimurium[J].PLoS One,2014,9(1):1-11.

[24]Hong H,Lim D,Kim G J,et al.Targeted deletion of the ara operon ofSalmonellatyphimuriumenhances L-arabinose accumulation and drives PBAD-promoted expression of anti-cancer toxins and imaging agent [J].Cell Cycle,2014,13(19):3112-3120.

[25]Wen M,Jung S,Moon K S,et al.Targeting orthotopic glioma in mice with genetically engineeredSalmonellatyphimurium[J].J Korean Neurosurg Soc, 2014,55(3):131-135.

[26]Westphal K,Leschner S,Jablonska J,et al.Containment of tumor colonizing bacteria by host neuthophils [J].Cancer Res,2008,68(8):2952-2960.

[27]Kim J E,Phan T X,Nguyen V H,et al.Salmonellatyphimuriumsuppresses tumor growth via the proinflammatory cytokine interleukin-1β [J].Theranostics,2015,5(12):1328-1342.

[28]閆妮娜.合肥地區(qū)犬腫瘤流行病學(xué)調(diào)查及臨床診斷技術(shù)的研究[D]．安徽合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[29]劉春暉，楊蕾，孫艷爭，等．北京地區(qū)犬腫瘤發(fā)生率調(diào)查[J]．中國獸醫(yī)雜志，2013，49(1)：63-64.

[30]朱國，師福山，楊楊.2012年—2014年杭州地區(qū)寵物犬腫瘤調(diào)查[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2015,36(11)：129-133.

[31]Dang L H,Bettegowda C,Huso D L,et al.Combination bacteriolytic therapy for the treatment of experimental tumors[J].Proc Nati Acad Sci,2001,98(26):15155-15160.

[32]Roberts N J,Zhang L,Janku F,et al.Intratumoral injection of clostridium novyi NT spores induces antitumor responses[J].Sci Trans Med,2014,6(249):1-11.

[33]張紅，張迪，金藝鵬，等.細(xì)菌治療犬自發(fā)性腫瘤的研究進展[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2016,52(2):66-68.

Progress on Bacteria Mediated Cancer Therapy

LIU Xian-de1,JIANG Sheng-nan2

(1.Department of Veterinary Medicine,Hainan University,Haikou,Hainan,570228,China;2.DepartmentofNuclearMedicine,HaikouPeople'sHospitalHaikou,Hainan,570208,China)

The tumor drugs have been rapidly developed such as chemosyntheses,herbal medicines,and gene therapy in recently,but we could not reach efficiently treatment of cancer.The tumor was colonized and suppressed by anaerobic or facultative anaerobic bacteria.The researcher reduced toxicity of anaerobic or facultative anaerobic bacteria and carried therapeutic molecules using new biotechnology,which provided a new direction for cancer therapy.If bacteria mediated tumor therapy can be used in pet clinicity,may provide new strategy for tumor therapy for dogs.

bacteria;tumor;pet clinic

2016-04-11

海南省應(yīng)用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項項目 (ZDXM20130067/ZDXM2015065)；海南省社會發(fā)展科技專項項目 (SF201421)

柳賢德(1979-)，男，吉林延邊人，副教授，博士，主要從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)研究。*通訊作者

S854.5

A

1007-5038(2016)09-0099-04