內(nèi)皮祖細胞與骨折愈合

林上進　程群

200040　上海，　　復旦大學附屬華東醫(yī)院骨科

?

內(nèi)皮祖細胞與骨折愈合

林上進程群

200040上海，復旦大學附屬華東醫(yī)院骨科

摘要內(nèi)皮祖細胞具有參與血管再生和修復的功能，以及分化為血管內(nèi)皮細胞和成骨細胞的潛能，在血管再生和新骨形成方面起到關鍵作用。骨折時，內(nèi)皮祖細胞被動員從骨髓遷移至外周循環(huán)來促進骨折愈合。內(nèi)皮祖細胞的移植治療開辟了骨折不愈合新的治療途徑。該文就內(nèi)皮祖細胞與骨折愈合作一綜述。

關鍵詞內(nèi)皮祖細胞；血管發(fā)生；新骨形成；骨折愈合

眾所周知，骨組織內(nèi)的脈管系統(tǒng)對骨組織重塑、骨生成及穩(wěn)態(tài)平衡有著不可或缺的作用。新的血管發(fā)生不僅對成骨有促進作用，而且對骨折后骨的修復起著關鍵作用，且血管的發(fā)生先于新骨形成[1]。骨折愈合是一個快速和有效的過程，它通過形成骨痂來填補骨折的裂縫和缺口，但有5%～10%的骨折患者愈合失敗，從而導致延遲愈合或永久不愈合。同時骨折愈合也是一個復雜而連續(xù)的過程，不僅涉及新骨形成，還存在新生血管再生過程。嚴重移位的粉碎性骨折會大大破壞骨折部位骨組織血管及其血供，從而增加骨折不愈合的風險[2]。在眾多骨折不愈合因素中，新生血管數(shù)量及功能不足是影響骨痂形成和骨痂骨重建最關鍵的因素之一。而內(nèi)皮祖細胞(EPC)是從骨髓釋放到外周血循環(huán)且具有多種分化潛能如分化成血管內(nèi)皮細胞、成骨細胞和造血細胞，從而參與骨折部位新生血管生成和新骨形成的一類細胞[3]。本文就EPC與骨折愈合作一綜述。

1EPC概述

Asahara等于1997年將體外培養(yǎng)的CD34+EPC成功分化成血管內(nèi)皮細胞，這一發(fā)現(xiàn)為血管再生和修復機制提供新的解釋，且提示EPC可能參與血管修復[4]。

1.1分化為血管內(nèi)皮細胞參與血管再生

EPC能在骨髓和外周循環(huán)中被發(fā)現(xiàn)，主要分布于骨髓中，外周血中數(shù)量較少，在骨髓中的EPC稱為骨髓內(nèi)皮祖細胞(BM-EPC)，在外周循環(huán)的EPC稱為循環(huán)內(nèi)皮祖細胞(cEPC)，cEPC是BM-EPC從骨髓遷移至外周循環(huán)而來，它們具有分化為成熟血管內(nèi)皮細胞的潛能。前期研究發(fā)現(xiàn)，當組織缺血或創(chuàng)傷時，機體通過釋放細胞因子和趨化因子等動員EPC從骨髓遷移到外周血，進而遷移到缺血部位且分化為成熟血管內(nèi)皮細胞參與新生血管建立。同理，骨折時EPC從骨髓遷移至外周循環(huán)，進而遷移至骨折部位以提高該組織的血管再生能力、新生毛細血管密度并促進新骨形成，從而促使骨折愈合[5]。 Laing等[6]研究發(fā)現(xiàn)，當人體發(fā)生創(chuàng)傷導致組織缺血時，cEPC的數(shù)量較正常時增高，提示當機體出現(xiàn)組織缺血或血管受損時，EPC作為一種新型的血管內(nèi)皮前體細胞從骨髓釋放至外周循環(huán)是對組織創(chuàng)傷的一種代償反應。Yao等[7]向心肌梗塞小鼠模型注射標記SPIO的EPC，經(jīng)MRI檢查發(fā)現(xiàn)這些標記的EPC聚集在心肌梗塞缺血區(qū)域，這進一步證實EPC具有向缺血部位遷移并分化成血管內(nèi)皮的潛能。關于機體促使EPC從骨髓遷移至組織缺血部位及分化為血管內(nèi)皮細胞的病理生理機制尚未完全明確，但目前多數(shù)研究認為組織損傷釋放的炎性因子、趨化因子、細胞因子及蛋白水解酶等可能與EPC釋放和遷移有關。Shen等[8]研究認為，白細胞介素(IL)-8可能是促使EPC遷移至組織缺血部位的重要因子。Huang 等[9]的體外實驗發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶B(AKT)信號轉導通路對于EPC的遷移、增殖及分化起著不可缺少的作用。Cheng等[10]研究發(fā)現(xiàn)，EPC通過在心肌缺血區(qū)域高表達血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)-2、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)、一氧化氮(NO)等介質(zhì)來促進血管再生和血管修復。

1.2分化為成骨細胞參與新骨形成

EPC不僅具有分化成血管內(nèi)皮細胞的功能，而且還可能具有分化為成骨細胞的能力。Bick等[11]在體外實驗中成功將cEPC培育分化為成骨細胞，提示EPC可能具有分化為成骨細胞的潛能。 Ford等[12]研究發(fā)現(xiàn)，骨折部位周圍存在一些成骨細胞能表達與EPC相同的表面標志物CD34。Gossl等[13]研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈粥樣硬化患者血循環(huán)中表達骨相關蛋白和骨鈣素的EPC比例較正常人高，且在早期動脈粥樣硬化患者冠狀循環(huán)中還能檢測到表達骨鈣素的EPC。Zampetaki等[14]研究發(fā)現(xiàn)，EPC從骨髓被動員進入外周循環(huán)至血管損傷部位參與血管修復過程中，作為血管內(nèi)皮前體細胞對骨代謝和血管內(nèi)皮系統(tǒng)產(chǎn)生了影響。Pirro等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在絕經(jīng)后女性體內(nèi)表達骨鈣素或堿性磷酸酶的CD34+細胞數(shù)量與機體內(nèi)骨轉化率呈正相關。Peris等[16]研究認為，EPC表達這些骨相關蛋白可能會促使血管鈣化誘發(fā)動脈粥樣硬化而不僅是參與血管修復或再生。此外，F(xiàn)lammer等[17]研究發(fā)現(xiàn)在高水平糖化血紅蛋白的糖尿病患者體內(nèi)可檢測到高濃度的共表達骨鈣素蛋白的EPC，這也間接表明EPC具有分化成成骨細胞的潛能并能表達成骨相關蛋白。

1.3分期

EPC包含早期EPC和晚期EPC兩個亞群，每個亞群的表面標志物不相同。早期EPC不成熟，可表達造血干細胞標志物CD133和CD34，進入分化階段后，造血干細胞標志物逐漸消失，開始表達內(nèi)皮細胞標志物如血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)、血管性血友病因子(vWF)、CD31和一氧化氮合酶，分化成為晚期EPC[18]。目前認為早期EPC為CD133+/CD34+/VEGFR-2+，而晚期EPC為CD34+/VEGFR-2+/CD31+/VE-cadherin+/vWF+，明顯失去CD133，并開始表達vWF。但大多數(shù)研究表明，EPC的常用特征性表面標志為CD34、CD133及VEGFR-2。CD34是Ⅰ型跨膜糖蛋白，表達于造血干細胞、造血祖細胞、胚胎纖維母細胞及血管內(nèi)皮細胞表面。CD133是一種5次跨膜的細胞表面分子，表達于骨髓和外周血造血干細胞及EPC表面，是區(qū)分EPC與成熟內(nèi)皮細胞的主要指標。VEGFR-2是一種酪氨酸激酶受體，分布于成熟內(nèi)皮細胞及EPC表面[19]。因此，目前研究EPC的分離和鑒定主要通過免疫檢測CD34、CD133及VEGFR-2表達情況。此外，EPC在不同發(fā)展階段所具備的作用也不相同。晚期EPC較早期EPC更具有增殖分化能力，而早期EPC則在主動分泌血管生長因子等旁分泌作用方面更甚一籌[16]。Minami 等[20]根據(jù)培養(yǎng)時間長短對EPC進行分期，將培養(yǎng)基培養(yǎng)3～7 d的EPC定義為早期EPC，培養(yǎng)10～16 d的EPC為中期EPC，培養(yǎng)17～23 d的EPC為晚期EPC，培養(yǎng)24～30 d的EPC為超晚期EPC，發(fā)現(xiàn)晚期EPC增殖分化能力和集落形成能力最強。

1.4影響因素

EPC既是血管內(nèi)皮細胞前體細胞，也是成骨細胞和造血細胞前體細胞，是具有游走遷移性、增殖分化及自我更新的定向干細胞，任何影響其凋亡、增殖、歸巢、分化等生理活動的因素或病理狀態(tài)均可使外周循環(huán)EPC數(shù)量減少，進而影響血管再生和新骨形成。Toupadakis等[21]研究發(fā)現(xiàn)，AMD3100作為趨化因子受體-4(CXCR4)拮抗劑通過抑制基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)/CXCR4軸作用來動員EPC從骨髓向外周循環(huán)釋放，從而增加cEPC的數(shù)量。Huang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，每日攝入適量紅酒可提高cEPC水平及改變NO生物利用度而提高EPC功能，從而減少冠心病發(fā)病率。Antonio等[22]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者cEPC水平較正常人明顯下降，表明高血糖狀態(tài)會減少cEPC數(shù)量并影響其功能，這是糖尿病患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的可能發(fā)病機制之一。Silva等[23]報道，長而持久的運動會增加外周循環(huán)VEGF釋放以促進cEPC數(shù)量并提高其增殖分化為血管內(nèi)皮的能力。

2EPC在骨折愈合中的作用機制

骨組織是一種含有豐富血管的組織，它的生長、重塑及修復過程需要血管內(nèi)皮細胞和骨細胞存在緊密的時間和空間聯(lián)系，故影響骨折愈合的主要因素是血供不足及血管-骨偶聯(lián)過程受到破壞[24]。對于骨折不愈合或延遲愈合的患者，帶血管蒂自體骨移植或異體骨移植被認為是唯一能夠解決骨不連部位血供問題的傳統(tǒng)方法，但帶血管蒂骨移植手術要求術者具備熟練的顯微血管外科技術和超長時間的手術操作毅力，此外自體骨移植也有一定的失敗率及移植后并發(fā)癥發(fā)生率，其主要原因是由于移植骨血管再生困難導致的血供不足[25]。而骨組織工程學和細胞治療學在過去10年內(nèi)的迅速發(fā)展給骨折不愈合治療帶來了新希望，EPC作為一種新的內(nèi)皮細胞來源，參與組織缺血后血管再生、血管內(nèi)皮修復及組織血循環(huán)復蘇，在再生醫(yī)學領域上應用較多[26]。

當機體發(fā)生骨折導致血管損傷并破壞骨組織的血供及骨的完整性時，骨折部位向血循環(huán)釋放炎性因子、細胞因子等炎癥介質(zhì)，細胞因子動員骨髓中的EPC向外周循環(huán)遷移，且靶向到達缺血部位，從而參與骨折部位骨生成和血管生成，最終盡快恢復骨折部位血供和促進骨折愈合[24]。近期研究[27]發(fā)現(xiàn)，骨折患者外周循環(huán)內(nèi)cEPC數(shù)量在骨折24 h后升高，3 d后達到高峰，較正常人cEPC數(shù)量明顯增多，且差異具有統(tǒng)計學意義。這也支持骨折可以誘發(fā)機體動員EPC從骨髓遷移至外周循環(huán)，最終到達骨折部位參與骨折愈合修復的結論。EPC參與骨生成、血管生成的病理生理機制和動力學機制，目前尚未明確。它促進骨折愈合的可能機制有2種：①EPC具有分化為血管內(nèi)皮細胞和成骨細胞的潛能，為兩種細胞的前體細胞。大量研究表明，表達CD34的EPC在體外能分化成成骨細胞[13]和血管內(nèi)皮細胞[28-30]以促進骨折部位新骨形成和新生血管形成。有學者[2]為證明這一假設,經(jīng)靜脈注射免疫標記的CD34+細胞至骨折動物模型內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這些細胞被靶向遷移至骨折部位且2周后表達出與人類特有的內(nèi)皮細胞和成骨細胞相同的細胞表面標志物。②EPC通過旁分泌機制分泌VEGF來促進血管內(nèi)皮生成和新生骨形成。Kuroda等[31]研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射VEGF拮抗劑組骨折部位血管內(nèi)皮細胞和成骨細胞數(shù)量較未注射組明顯減少，兩者差異具有統(tǒng)計學意義。Li等[32]研究發(fā)現(xiàn)，將帶有VEGF基因的纖維母細胞移植至兔骨折模型可明顯促進骨折愈合。Pufe等[33]研究發(fā)現(xiàn)，骨折愈合早期VEGF對骨折愈合起非常重要的作用，且VEGF的峰值在骨折5 d后開始逐漸下降。Li等[34]移植EPC支架至大鼠骨折部位來促進骨折愈合，結果發(fā)現(xiàn)骨折部位VEGF基因表達明顯升高。骨折引起的缺血和VEGF釋放可促進新生毛細血管內(nèi)皮細胞分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2和上調(diào)BMP-2 mRNA表達，BMP-2作為成骨因子對新生骨形成起直接促進作用[35]。因此，當骨折發(fā)生時EPC在骨折部位釋放的炎性因子、細胞因子、趨化因子等介導下從骨髓遷移至外周血循環(huán)，再被靶向招募至骨折部位，然后EPC分化成血管內(nèi)皮細胞和成骨細胞并釋放VEGF，從而為骨折愈合和血流恢復提供最適宜的微環(huán)境。

3 EPC在骨折愈合中的應用

EPC作為新生血管內(nèi)皮細胞的祖細胞，能對缺血組織進行反應并在第一時間進入缺血部位以刺激新生血管形成和修復損傷組織，它還具有分化成血管內(nèi)皮細胞和成骨細胞的潛能，以及快速增殖的能力。但EPC對骨折愈合的治療目前主要處于臨床前研究階段，臨床應用至今報道較少。

EPC移植治療研究主要可分為2個階段：①經(jīng)靜脈注射進行EPC移植治療來觀察血管損傷修復的效果，主要應用在心血管系統(tǒng)疾病治療方面。Fang等[36]通過兔子耳緣靜脈注射體外擴增的自體EPC來促進動脈瘤修復和內(nèi)皮增生。Iwasaki等[37]通過靜脈注射人EPC促進大鼠心肌和血管再生來恢復心肌泵血功能。Matsumoto等[38]通過靜脈注射人EPC來促進壞死骨組織的血管修復和新生血管形成，進而促進骨折愈合。②通過生物載體進行EPC局部移植來促進骨折愈合效果，主要應用于骨折愈合或創(chuàng)傷骨科方面。鑒于靜脈注射EPC是全身性反應，移植的EPC不僅能有效促進骨折愈合，而且這些細胞還會遷移至其他組織和器官如肺、肝、胸腺、腦等，可能在骨外組織產(chǎn)生一些無法預見和控制的遠期影響，故目前EPC對骨折愈合影響的研究基本采用局部移植方法。Rozen等[39]在兔骨折模型骨折端之間人為構建一楔形纖維竇道，移植預先在體外擴增的EPC至該纖維竇道中，經(jīng)顯微CT檢查發(fā)現(xiàn)EPC局部移植能在骨折缺損處促進形成大量致密的編織骨以達到骨折愈合。Atesok等[40]在大鼠股骨骨折模型中運用無菌明膠海綿載體局部移植EPC，發(fā)現(xiàn)EPC移植治療組骨折全部愈合，而對照組骨折全部不愈合。Li等[2]利用明膠海綿為載體局部移植EPC治療大鼠股骨骨折，發(fā)現(xiàn)局部EPC移植治療不僅能促進骨折愈合，還能提高骨的微結構和生物力學穩(wěn)定性。以上研究均提示，EPC對于骨折尤其是骨折延遲愈合、骨折不愈合和骨組織缺損患者有潛在而明顯的治療效果?；谝陨涎芯?，Kuroda等[41]首次進行運用自體EPC治療骨折不愈合的病例報道，他們運用膠原蛋白支架來承載粒細胞集落刺激因子(G-CSF)動員的自體EPC并采用髂前上棘進行自體骨移植，將支架移植至脛骨不愈合斷端，結果顯示患者術后無嚴重不良事件發(fā)生，且在術后9個月骨折成功愈合。隨后Kuroda等[42]又運用膠原蛋白支架承載G-CSF動員的自體EPC移植治療7例骨折不愈合，術后隨訪1年，結果無不良及嚴重并發(fā)癥出現(xiàn)，且術后12周5例(71.4%)達到影像學骨折愈合，遠遠超過根據(jù)歷史資料制定的預先設定閾值(18.1%)。隨著臨床Ⅰ/Ⅱa期實驗的進行，EPC移植治療在人體實驗中獲得較大的成就，且獲得和分離創(chuàng)傷小、安全、有效，不像骨髓間質(zhì)干細胞只能麻醉下通過手術從骨髓中提取[43]，這些都對EPC 在骨折不愈合中的應用具有巨大的推動作用。

動物實驗和有限的體內(nèi)研究顯示，EPC能明顯促進新生血管生成和新生骨形成，提高骨折愈合能力。但血管形成與骨發(fā)生在空間和時序上有怎樣的聯(lián)系；它們對骨轉換和破骨細胞的功能作用如何；既然EPC具有分化為成骨細胞的潛能，那么EPC在骨質(zhì)疏松性骨折，甚至預防和治療成骨功能低下引起的骨質(zhì)疏松癥方面是否也同樣有效，這需要對EPC促進骨折愈合的分子生物學機制進一步理解和探索。相信在不久的將來，體外擴增的自體EPC移植治療將會成為骨折不愈合的重要治療策略。

參考文獻

[1]Saran U, Piperni SG, Chatterjee S. Role of angiogenesis in bone repair[J]. Arch Biochem Biophys, 2014, 561(2):109-117.

[2]Li R, Atesok K, Nauth A, et al. Endothelial progenitor cells for fracture healing: a microcomputed tomography and biomechanical analysis[J]. J Orthop Trauma, 2011, 25(8):467-471.

[3]Bai YY, Peng XG, Wang LS, et al. Bone marrow endothelial progenitor cell transplantation after ischemic stroke: an investigation into its possible mechanism[J]. CNS Neurosci Ther, 2015, 21(11):877-886.

[4]Asahara T, Murohara T, Sullivan A, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J]. Science, 1997, 275(5302):964-967.

[5]Matsumoto T, Mifune Y, Kawamoto A, et al. Fracture induced mobilization and incorporation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for bone healing[J]. J Cell Physiol, 2008, 215(1):234-342.

[6]Laing AJ, Dillon JP, Condon ET, et al. Mobilization of endothelial precursor cells: systemic vascular response to musculoskeletal trauma[J]. J Orthop Res, 2007, 25(1):44-50.

[7]Yao Y, Li Y, Ma G, et al. In vivo magnetic resonance imaging of injected endothelial progenitor cells after myocardial infarction in rats[J]. Mol Imaging Biol, 2011, 13(2):303-313.

[8]Shen WC, Liang CJ, Wu VC, et al. Endothelial progenitor cells derived from Wharton’s jelly of the umbilical cord reduces ischemia-induced hind limb injury in diabetic mice by inducing HIF-1α/IL-8 expression[J]. Stem Cells Dev, 2013, 22(9):1408-1418.

[9]Huang PH, Chen YH, Tsai HY, et al. Intake of red wine increases the number and functional capacity of circulating endothelial progenitor cells by enhancing nitric oxide bioavailability[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010, 30(4):869-877.

[10]Cheng Y, Jiang S, Hu R, et al. Potential mechanism for endothelial progenitor cell therapy in acute myocardial infarction: activation of VEGF-PI3K/Akte-NOS pathway[J]. Ann Clin Lab Sci, 2013, 43(4):395-402.

[11]Bick RN, Dreyfuss E, Soudry M, et al. Osteogenic differentiation of circulating endothelial progenitor cells[J]. J Bone Miner Res, 2007, 22(9):S143.

[12]Ford JL, Robinson DE, Scammell BE. Endochondral ossification in fracture callus during long bone repair: the localisation of ‘cavity-lining cells’ within the cartilage[J]. J Orthop Res, 2004, 22(2):368-375.

[13]Gossl M, Modder UI, Gulati R, et al. Coronary endothelial dysfunction in humans is associated with coronary retention of osteogenic endothelial progenitor cells[J]. Eur Heart J, 2010, 31(23):2909-2914.

[14]Zampetaki A, Kirton JP, Xu Q. Vascular repair by endothelial progenitor cells[J]. Cardiovasc Res, 2008, 78(3):413-421.

[15]Pirro M, Leli C, Fabbriciani G, et al. Association between circulating osteoprogenitor cell numbers and bone mineral density in postmenopausal osteoporosis[J]. Osteoporos Int, 2010, 21(2):297-306.

[16]Peris P, Atkinson EJ, Gossl M, et al. Effects of bisphosphonate treatment on circulating osteogenic endothelial progenitor cells in postmenopausal women[J]. Mayo Clin Proc, 2013, 88(1):46-55.

[17]Flammer AJ, Gossl M, Li J, et al. Patients with an HbA1c in the prediabetic and diabetic range have higher numbers of circulating cells withosteogenic and endothelial progenitor cell markers[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2012, 97(12):4761-4768.

[18]Ribatti D. The discovery of endothelial progenitor cells．An history review[J]. Leuk Res, 2007, 3l(4):439-444．

[19]Werling NJ, Thorpe R, Zhao Y. A systematic approach to the establishment and characterization of endothelial progenitor cells for gene therapy[J]. Hum Gene Ther Methods, 2013, 24(3):171-184.

[20]Minami Y, Nakajima T, Ikutomi M, et al. Angiogenic potential of early and late outgrowth endothelial progenitor cells is dependent on the time of emergence[J]. Int J Cardiol, 2015, 186:305-314.

[21]Toupadakis CA, Granick JL, Sagy M, et al. Mobilization of endogenous stem cell populations enhances fracture healing in a murine femoral fracture model[J]. Cytotherapy, 2013, 15(9):1136-1147.

[22]Antonio N, Fernandes R, Soares A, et al. Reduced levels of circulating endothelial progenitor cells in acute myocardial infarction patients with diabetes or pre-diabetes: accompanying the glycemic continuum[J]. Cardiovasc Diabetol, 2014, 13:101.

[23]Silva JF, Rocha NG, Nobrega AC. Mobilization of endothelial progenitor cells with exercise in healthy individuals: a systematic review[J]. Arq Bras Cardiol, 2012, 98(2):182-191.

[24]Zigdon-Giladi H, Rudich U, Michaeli-Geller G, et al. Recent advances in bone regeneration using adult stem cells[J]. World J Stem Cells, 2015, 7(3):630-640.

[25]Sen MK, Miclau T. Autologous iliac crest bone graft: should it still be the gold standard for treating nonunions?[J]. Injury, 2007, 38(suppl 1):S75-S80.

[26]Seebach C, Henrich D, Kahling C, et al. Endothelial progenitor cells and mesenchymal stem cells seeded onto beta-TCP granules enhance early vascularization and bone healing in a critical-sized bone defect in rats[J]. Tissue Eng Part A, 2010, 16(6):1961-1970.

[27]Ma XL, Sun XL, Wan CY, et al. Significance of circulating endothelial progenitor cells in patients with fracture healing process[J]. J Orthop Res, 2012, 30(11):1860-1866.

[28]Fukui T, Matsumoto T, Mifune Y, et al. Local transplantation of granulocyte colony-stimulating factor-mobilized human peripheral blood mononuclear cells for unhealing bone fractures[J]. Cell Transplant, 2012, 21(4):707-721.

[29]Kawakami Y, Ii M, Alev C, et al. Local transplantation of ex vivo expanded bone marrow-derived CD34-positive cells accelerates fracture healing[J]. Cell Transplant, 2012, 21(12):2689-2709.

[30]Kawakami Y, Ii M, Matsumoto T, et al. A small interfering RNA targeting Lnk accelerates bone fracture healing with early neovascularization[J]. Lab Invest, 2013, 93(9):1036-1053.

[31]Kuroda R, Matsumoto T, Kawakami Y, et al. Clinical impact of circulating CD34-positive cells on bone regeneration and healing[J]. Tissue Eng Part B Rev, 2014, 20(3):190-199.

[32]Li R, Stewart DJ, von Schroeder HP, et al. Effect of cell-based VEGF gene therapy on healing of a segmental bone defect[J]. J Orthop Res, 2009, 27(1):8-14.

[33]Pufe T, Wildemann B, Petersen W, et al. Quantitative measurement of the splice variants 120 and 164 of the angiogenic peptide vascular endothelial growth factor in the time flow of fracture healing: a study in the rat[J]. Cell Tissue Res, 2002, 309(3):387-392.

[34]Li R, Nauth A, Li C, et al. Expression of VEGF gene isoforms in a rat segmental bone defect model treated with EPCs[J]. J Orthop Trauma, 2012, 26(12):689-692.

[35]Bouletreau PJ, Warren SM, Spector JA, et al. Hypoxia and VEGF up-regulate BMP-2 mRNA and protein expression in microvascular endothelial cells: implications for fracture healing[J]. Plast Reconstr Surg, 2002, 109(7):2384-2397.

[36]Fang X, Zhao R, Wang K, et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are involved in aneurysm repair in rabbits[J]. J Clin Neurosci, 2012, 19(9):1283-1286.

[37]Iwasaki H, Kawamoto A, Ishikawa M, et al. Dose-dependent contribution of CD34-positive cell transplantation to concurrent vasculogenesis and cardiomyogenesis for functional regenerative recovery after myocardial infarction[J]. Circulation, 2006, 113(10):1311-1325.

[38] Matsumoto T, Kawamoto A, Kuroda R, et al. Therapeutic potential of vasculogenesis and osteogenesis promoted by peripheral blood CD34-positive cells for functional bone healing[J]. Am J Pathol, 2006, 169(4):1440-1457.

[39]Rozen N, Bick T, Bajayo A, et al. Transplanted blood-derived endothelial progenitor cells (EPC) enhance bridging of sheep tibia critical size defects[J]. Bone, 2009, 45(5):918-924.

[40]Atesok K, Li R, Stewart DJ, et al. Endothelial progenitor cells promote fracture healing in a segmental bone defect model[J]. J Orthop Res, 2010, 28(8):1007-1014.

[41]Kuroda R, Matsumoto T, Miwa M, et al. Local transplantation of G-CSF-mobilized CD34(+) cells in a patient with tibial nonunion: a case report[J]. Cell Transplant, 2011, 20(9):1491-1496.

[42]Kuroda R, Matsumoto T, Niikura T, et al. Local transplantation of G-CSF-mobilized CD34+ cells for patients with femoral and tibial nonunion: phase 1/2 clinical trial. Stem Cells Transl Med, 2013, 328:41.

[43]Knight MN, Hankenson KD. Mesenchymal stem cells in bone regeneration[J]. Adv Wound Care (New Rochelle), 2013, 2(6):306-316.

(收稿：2015-04-29; 修回：2015-11-30)

(本文編輯：盧千語)

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.01.008

通信作者：程群E-mail: quncheng_2014@163.com

基金項目：國家自然科學基金(81471089)、上海市衛(wèi)生系統(tǒng)重要疾病聯(lián)合攻關項目(2013ZYJB0801)