非洲豬瘟檢測技術研究進展

王子堅，賀奮義，郭慧琳，魏潤生(甘肅省動物疫病預防控制中心，甘肅 蘭州　730046)

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非洲豬瘟檢測技術研究進展

王子堅，賀奮義，郭慧琳，魏潤生
(甘肅省動物疫病預防控制中心，甘肅 蘭州730046)

摘要：非洲豬瘟是一種外來疫病，在我國存在輸入性風險。本文介紹了非洲豬瘟幾種診斷方法的研究進展，為該病的診斷和有效防控提供了理論依據。

關鍵詞：非洲豬瘟；鑒別診斷；檢測技術

非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)又稱非洲豬瘟疫，是由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染引起的一種嚴重危害豬及野豬的動物傳染病，其病程短，死亡率高達100 %。該病屬于世界動物衛(wèi)生組織(OIE)要求報告的動物疫病，在我國動物病原微生物名錄中列為一類動物疫病[1-3]。我國目前尚未有發(fā)生本病的報道，但由于我國是以農業(yè)為主的養(yǎng)豬大國，國際貿易往來頻繁，存在輸入性風險。因此，掌握ASF診斷方法，對防止ASF的傳入具有重要意義。

1　非洲豬瘟的診斷

非洲豬瘟綜合癥狀復雜，在臨床上難以和豬瘟區(qū)別診斷。豬感染ASFV后雖可產生特異性抗體，但這些抗體沒有中和作用，也缺乏有效的保護性。耐過豬對同型毒株的有抵抗力，但對異源毒株極為敏感，至今仍沒有可預防的疫苗?？鼓?、脾和淋巴結等是用于診斷非洲豬瘟的常用材料。送檢樣本時應盡量冷藏或浸于甘油鹽水中。根據流行病學、臨診癥狀和病理剖解可對ASF做初步診斷，確診可通過病原學檢測、血清學檢測和分子生物學檢測[4,5]。

1.1 非洲豬瘟的臨床癥狀

豬感染ASFV后的潛伏期一般為5 d～15 d，根據感染毒株毒力的不同，臨床癥狀可分為最急性、急性、亞急性和慢性四種類型。最急性型由強毒株感染引起，常無臨床癥狀突然死亡，死亡率高達100 %。急性型病豬體溫40.5 ℃～42 ℃，以高熱、出血和高死亡率為特征，精神沉郁，食欲減退，運動失調，局部皮膚發(fā)紅或發(fā)藍、可視黏膜潮紅、眼有分泌物、嘔吐、腹瀉、咳嗽、呼吸困難和懷孕母豬流產等癥狀，死亡率可達100 %。亞急性型由中等毒力毒株感染引起，癥狀較輕，病死率較低，間斷性發(fā)熱持續(xù)1個月之久，呼吸窘迫、關節(jié)疼痛、腫脹，懷孕母豬常常流產。慢性型由低毒力毒株感染引起，除波狀熱、生長減慢、發(fā)育遲緩或瘦弱外，不表現明顯的癥狀。

1.2 非洲豬瘟實驗室檢測

1.2.1 非洲豬瘟的病原學檢測

非洲豬瘟病原學診斷主要包括病毒分離、熒光抗體試驗(FAT)、雙抗體夾心ELISA等診斷技術。

病毒分離：非洲豬瘟病毒的分離要在具有三級生物安全(BSL-3)以上的生物安全實驗室中進行，分離樣本可以是豬血液及器官組織，包括脾臟、肝臟、肺臟及心臟。豬外周血單核細胞是常用的初次分離病毒的細胞，感染ASFV時，單層豬外周血單核細胞具有血細胞吸附特性及細胞死亡，以此來指示分離的病毒呈陽性。

熒光抗體試驗(FAT)：非洲豬瘟抗原能夠與標記有熒光素的抗ASFV特異性抗體相結合，用于野外可疑豬或實驗室接種豬病變組織的ASFV抗原檢測，也可以用于鑒定無紅細胞吸附能力的毒株及區(qū)分非洲豬瘟病毒和偽狂犬病毒在細胞上形成的細胞病變。雖然該方法檢測快速、敏感性和特異性都高，但是由于實驗需要昂貴的熒光顯微鏡和高質量的熒光標記抗體，再加上熒光素標記技術要求高，需要專業(yè)實驗員，目前該方法僅作為診斷ASFV的輔助檢測方法。

雙抗體夾心ELISA：特異性單克隆抗體包被酶標板，加入待檢樣本后，如果樣本中含有目的抗原，則抗原與單抗特異性結合，再加入抗原另一表位的酶標單抗，形成類似雙抗體夾心復合物，加入底物顯色后指示抗原的存在。Vidal等以抗非洲豬瘟病毒抗原性結構蛋白VP73蛋白的特異單克隆抗體為基礎建立了夾心ELISA方法。INGENASA夾心ELISA試劑盒，以包被的P72(又稱P73)單抗檢測樣本中的病毒抗原，可以檢測血液及多種組織中的病毒抗原，特異性、敏感性均很好，是OIE指定的ASFV檢測試劑盒。算，從而評價陽性樣本抗體含量及結合力，與間接ELISA或夾心ELISA結果相反，顯色反應后陽性樣本檢測孔呈色淺，OD值低。該方法的出現為非洲豬瘟的診斷提供了一種無感染性的實驗室診斷方法，特別是對于還沒有發(fā)生非洲豬瘟疫情的國家來講更具有現實意義，INGENASA阻斷ELISA試劑盒，以VP73病毒蛋白為包被抗原檢測非洲豬瘟特異抗體，為OIE指定參考的非洲豬瘟診斷試劑盒。

1.2.3 分子生物學檢測方法

1.2.2 血清學檢測方法

血清學檢測方法有間接免疫熒光試驗、血凝試驗、競爭ELISA或阻斷ELISA等。

免疫熒光試驗的優(yōu)點是敏感性高和快速，但難以實現對樣本的大批量檢測，且自動化程度不高。FAT的優(yōu)點是簡單、特異，靈敏。但是熒光素存在非特異性染色的弊端，導致試驗結果出現假陽性。所以FAT被OIE列為檢測ASF的輔助方法。

血凝試驗具備的優(yōu)點是靈敏度高，可以有效地降低假陽性率，可靠性強。缺點是費時，不易操作，對紅細胞的新鮮度有要求，實驗效果也受到細胞形態(tài)的直接影響，而且非血球吸附的毒株會導致假陰性，有一定的局限性，故該方法很難在ASF感染的早期做出檢測，只能作為輔助檢測。

競爭ELISA或阻斷ELISA：利用待檢血清樣本與特異酶標單抗同時或先后與包被抗原結合反應，如果待檢血清當中含有針對抗原的特異性抗體，將會抑制包被抗原與單抗的結合，樣本抑制率根據陰陽性樣本的OD值計

核酸檢測：基于多聚酶鏈式反應(PCR)的核酸檢測技術，具有易操作、敏感性高、特異性強、對樣本要求不高等優(yōu)點，能夠實現早期診斷，是非疫區(qū)檢測疫病的重要手段之一。根據ASFV基因組中含有的高度保守基因序列設計特異性引物進行擴增達到ASFV核酸的檢測目的。PCR技術不僅快速、靈敏，而且對檢測樣本來源要求較低，組織、血液、分泌物等都可以作為ASFV DNA的檢測樣本，能從出現臨床癥狀前病豬采集的樣本中檢測病毒DNA，實現早期診斷。

隨著分子生物學的發(fā)展，熒光定量PCR、多重PCR技術以及新興的環(huán)介導恒等溫核酸擴增技術(LAMP)等方法較普通PCR技術在ASFV核酸檢測方面顯示出了巨大的優(yōu)勢，并日益得到廣泛的應用。

目前，成熟的PCR檢測方法主要選取ASFV的P72基因作為目的基因，根據不同毒株P72基因的高度保守序列設計出引物，抽提樣本中病毒的DNA作為模板，建立的PCR方法能夠有效地檢測出脾臟等組織中的病毒。John McKillen等建立的PCR方法，可以鑒別診斷出ASF和古典豬瘟[6]。在此基礎上，Mckillen還建立了Real-time PCR，與普通PCR相比，其靈敏度和特異性更強，對樣本中的核酸可以做到實時定量檢測，同時可有效降低電泳過程中瓊脂糖凝膠對PCR結果的影響，結果更加直觀。國內的蔣正軍、孫懷昌等也建立了Taq Man探針，取得了良好的效果。但該方法的缺點是定量PCR儀價格昂貴，成本較高，對試驗耗材要求高，偶爾會產生假陽性的結果。

Bastos等通過設計的兩對引物，建立了巢式PCR，再次從普通PCR檢出結果為陰性的60份樣本中，檢測出近20份陽性[7]。該方法也可用于檢測軟蜱體內的ASFV，靈敏度良好。在靈敏度方面，相比于傳統(tǒng)的病毒分離法和OIE的PCR方法，Bastos等建立的巢式PCR更有優(yōu)勢。江彥增等建立了ASFV的等溫環(huán)介導擴增法，在爆發(fā)疫情的野外和不具備試驗條件的地區(qū)，該方法亦可對ASFV進行檢測[8]。

2 小結

隨著非洲豬瘟在我國周邊國家和地區(qū)的發(fā)生與流行，提示我們必須加強對非洲豬瘟的防控工作，對非洲豬瘟的診斷技術要不斷研究，盡快開發(fā)出可鑒別非洲豬瘟的快速、特異且敏感的診斷方法，這些對預防和控制非洲豬瘟在我國的流行具有十分重要的意義?！酢?/p>

參考文獻：(10篇，略)

中圖分類號：S828.28

文獻標識碼：A

文章編號：1001-0769(2016)01-0048-02