淺談影響種公牛凍精生產(chǎn)的若干技術(shù)因素

韓　星

(遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟管理站，遼寧 沈陽 110032)

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淺談影響種公牛凍精生產(chǎn)的若干技術(shù)因素

韓星

(遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟管理站，遼寧 沈陽 110032)

摘要：通過對凍精生產(chǎn)中，能夠影響精子生命的幾個環(huán)節(jié)(采精、精夜稀釋、冷凍技術(shù)、解凍方法等)存在的問題及影響因素進行分析研究，提出了提高精液質(zhì)量的建議。

關(guān)鍵詞：種公牛；凍精；質(zhì)量

隨著應(yīng)用冷凍精液進行人工輸精技術(shù)的推廣普及，對冷凍精液的數(shù)量需求逐漸擴大，同時對凍精產(chǎn)品質(zhì)量的要求也提高了。然而在凍精生產(chǎn)過程中對精子造成傷害的因素有很多。因此，在制作凍精時，一定要設(shè)法使破壞精子生命力的因素減少到最低程度以致消除。通過對凍精制作中幾個環(huán)節(jié)的分析，以尋求有利于精子生命的最佳制作條件。

1采精技術(shù)及精液品質(zhì)檢查的影響

1.1采精技術(shù)的影響

采精是凍精生產(chǎn)的第一個環(huán)節(jié)，采精技術(shù)的好壞直接影響到精液的質(zhì)量。在采精過程中，技術(shù)是否熟練及假陰道的壓力、溫度、潤滑度是否適宜，對精液是否成功采集十分重要。采精所用的種公牛必須保證體質(zhì)健壯，無肺疫、結(jié)核病、布氏桿菌病等傳染病。對于成年種公牛每周采精兩次，每次可根據(jù)具體情況和需要連續(xù)采精兩回。采精過頻會導致精液量少，密度低。長時間不采，會導致所采精液中死精過多，兩者都不利于凍精生產(chǎn)和種公牛生產(chǎn)潛力的發(fā)揮。

為保證所采精液不受污染，采精場地應(yīng)事先打掃干凈，并做好消毒工作。采精前公牛的后軀，特別是尾根肛門等部位先用溫水徹底清洗干凈，再用干凈抹布擦干。種公牛的陰莖和包皮先用溫水洗凈，然后用滅菌生理鹽水沖洗干凈。此外，采精前種公牛還需要一個性準備的過程。實踐證明，公牛采精前性準備充分與否直接影響到采精量、精子的活率和密度。因此在采精前常用一些誘情方法，如是公牛在母牛附近停留片刻進行多次空爬跨或讓待采精的公牛觀摩另一頭公牛爬跨等。這些準備活動有助于精液質(zhì)量的提高。

1.2精液品質(zhì)的影響

精液采下后要對其品質(zhì)進行檢查。首先是肉眼觀察，正常精液一般為乳白色或淡黃色。如精液帶綠色，則精液中有膿液或尿液；若帶紅色或紅褐色，可判斷該牛有炎癥。這時精液應(yīng)該廢棄不能進行冷凍。對于肉眼檢查合格的精液，還要進一步通過顯微檢查，查看精子密度、活率、畸形率、頂體完整率的情況，對于低于規(guī)定標準的精液要廢棄。經(jīng)檢查各項指標合格者，才能進一步稀釋、冷凍。只有精液原液的質(zhì)量好，才能保證凍精的質(zhì)量。為防止低溫對凍精的冷打擊，檢查過程需把精液放在30 ℃的水浴中，以免影響精子的活力。

日光燈對精子有不良影響，日光照射也如此，因此在進行精液檢查時應(yīng)盡量減少不必要的光照。同時，還要避免對精子有害射線的輻射。

2稀釋液的配制及甘油含量的影響

2.1稀釋液保護劑對冷凍前精子活力的影響

稀釋液保護劑的好壞對冷凍前精子的活力有很大的影響。配制稀釋液所用的藥品試劑必須是分析純的，蒸餾水用重蒸餾的，要求純凈、新鮮。藥品試劑按一定比例混合，溶解過濾，還要密封消毒處理，以確保對精子無害或危害甚微。消毒采用煮沸的方法，煮沸時間不宜過長，以防止炭化變質(zhì)，起不到保護精子的作用。抑制細菌的青鏈霉素不是多多益善，一般按每100 mL稀釋液加50～100萬單位，用量過多對精子有殺害作用。

2.2 血細胞常規(guī)和骨髓細胞形態(tài)分析 骨髓中原始細胞比例，外周血中白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)和血小板(PLT)的量在CD56+和CD56-組間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.2甘油對精子活力的影響

稀釋液既是精液的營養(yǎng)成分，又是保護劑，甘油是其中的冷凍保護劑之一。甘油的保護作用是通過減緩水的結(jié)晶過程，縮小危險溫區(qū)的范圍來實現(xiàn)的。但并非是加入保護劑后，危險溫區(qū)就不存在了，牛精子的危險溫區(qū)是0～-60 ℃，其中最危險的溫區(qū)是-15 ℃～-25 ℃。通過稀釋液中加入甘油后，能沖淡溶液的濃度，也就是說甘油代替一部分游離水進入精子細胞內(nèi)，使游離水連同無機鹽一起被排除，降低細胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度，阻止在-15 ℃以下引起精子蛋白質(zhì)變性，在冷凍過程中起到一定的保護作用。此外，甘油還容易通過細胞膜，解凍時能保護精子免受稀釋性傷害，還可使精子中的G07酶免受凍害而溢出。

實踐證明，甘油在常溫下對精子有害，可以損傷精子頂體和破壞某些酶。因此，稀釋液中不可沒有甘油，但又要減少其含量。據(jù)各種資料報道牛精液稀釋液保護劑中甘油含量減少到5%～7%效果較好。甘油含量減少到3.3%左右時效果會更好。但是目前采用的一次稀釋法無法控制甘油的最終濃度：比如10%的甘油稀釋液按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的比例稀釋，其最終甘油濃度分別為5.00%、6.60%、7.50%和8.00%?？梢钥闯?，稀釋比例越小最終甘油含量越少。而且經(jīng)測定，一次稀釋法G07酶漏到精子里，說明精子膜已受到傷害。

為了解決這兩個問題，人們在實踐中摸索出兩次稀釋的方法：第一次先加入無甘油的稀釋液，加到所需稀釋總量的一半，第二次(含甘油10%的稀釋液)加到所需總量，這樣一來，無論稀釋倍數(shù)多大，甘油濃度都是5%。但要注意，第二次需在降溫后緩慢加入，因為剛采到的活躍精子在高滲環(huán)境中受打擊很大。

3稀釋液溫度變化的影響

溫度影響精子的代謝率和活力，精子在體溫(37 ℃～38 ℃)情況下保持正常運動，如果高于這個溫度，則活動加劇。據(jù)有關(guān)實驗表明，精子能忍受的最高溫度約為41 ℃。精子在低溫環(huán)境下，代謝活動受到抑制。但是，使精液溫度緩慢降至0 ℃，對精子的存活力沒有影響，而溫度下降急劇，則會對精子的代謝、活動力、受精性能造成不可逆的不良影響。這是因為精子的細胞膜受到破壞，從而使三磷酸腺苷、紅細胞素、蛋白質(zhì)等從細胞膜破壞處漏出。精子的滲透壓增加，產(chǎn)生不可逆的變化，以致?lián)p害其結(jié)構(gòu)和活動力，這就是所謂的低溫打擊。鑒于此，在稀釋精液時一定要把稀釋液放在30 ℃左右的恒溫箱中，使所采新鮮精液和稀釋液處于同一溫度的水中。特別是在寒冷的冬季，自然狀態(tài)下的稀釋液會下降到0 ℃左右，而新采的精液卻比體溫略低，這樣30 ℃的鮮精液猛然和0 ℃左右的稀釋液相遇，會對精子造成不可逆的損傷，使相當一部分精子失去活力。稀釋液必須經(jīng)過預熱和新鮮精液處于同一溫度水平下進行稀釋。對于稀釋后的精液，應(yīng)放入低溫操作裝置中，使精液溫度緩慢降至0～5 ℃。

4冷凍技術(shù)因素的影響

精液冷凍是精液處理過程中相當關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)，冷凍技術(shù)的好壞對凍后精子活率的影響很大。如果此環(huán)節(jié)把握不好，即使前面的工作做的再好，也會前功盡棄。在精液冷凍技術(shù)中，由冷凍溫度和降溫速度構(gòu)成的冷凍溫度曲線是影響精子冷凍后活率、頂體完整率等的主要因素。冷凍過程中精子通過對細胞產(chǎn)生致死性傷害的危險溫區(qū)(0～60 ℃)速度，決定著冷凍后精子活率的高低。

4.1冷凍精液生產(chǎn)中的溫度變化

冷凍精液時，精液和冷凍環(huán)境之間有著120～180 ℃的溫差，因此二者之間存在著熱交換的過程，直到溫差為零，即達到所謂的熱平衡狀態(tài)，維持片刻后精液與冷凍面的溫度變化同步下降，達到要求的溫度后浸入液氮。精液降溫要求快速通過0～60 ℃的危險溫區(qū)，以保證冷凍精液的質(zhì)量。精液降溫的速度與冷凍容器、冷凍環(huán)境的溫度及每批精液冷凍總?cè)萘坑兄苯拥年P(guān)系。北京和洛陽種公牛站的測試結(jié)果表明，隨著每批冷凍精液量的增加，熱平衡溫度升高，降溫速度減慢，通過危險區(qū)的時間延長。增大冷凍容器的熱容量，減少精液部分的熱容量，特別應(yīng)注意承載精液的鋼架式冷凍板面必須經(jīng)預冷至始凍溫度，以加速精液的降溫速度，使精液盡快通過危險溫區(qū)。

4.2.1細管型

冷凍前冷凍槽中要倒入適量的液氮，蓋上槽蓋，使之有個預冷的過程。細管及管內(nèi)精液溫度凍前要求與承載細管的網(wǎng)架保持一致。往網(wǎng)架內(nèi)裝細管精液時在4～5 ℃的低溫箱內(nèi)進行操作，同時筐內(nèi)各網(wǎng)孔要盡量裝滿，以保證冷凍過程保持一定的降溫曲線。凍制細管精液并不是直接把金屬網(wǎng)架浸入冷凍槽中進行冷凍，這樣會造成大批精子死亡。冷凍時，金屬網(wǎng)架在液氮面上停留一會兒，保證始凍溫度在-8 ℃～-1.2 ℃范圍內(nèi)。北京種公牛站的測試結(jié)果表明，始冷凍在此范圍內(nèi)冷凍效果較好。目前承載細管精液用的是冷凍篩板或金屬網(wǎng)架，一次可冷凍細管數(shù)百支。

4.2.2顆粒型

顆粒精液用鋁板、銅網(wǎng)或聚四氟乙烯板等材料作為冷凍面，精液是陸續(xù)逐粒滴在冷凍面上。因此造成精液顆粒之間始凍溫度存在差異，隨著滴凍精液數(shù)量的增加冷凍面的溫度升高，始凍溫度也不斷升高。如果冷凍面質(zhì)量或?qū)嵝阅懿?，加之外界氣溫環(huán)境的影響，精液降溫速度緩慢，通過危險區(qū)的時間延長，很容易使精液進入危險溫區(qū)，造成冷凍效果不好。為了保證冷凍精液的效果，目前國內(nèi)使用聚四氟乙烯板凍制顆粒精液，充分利用它隔熱性能好這一特點，減少顆粒精液之間的始凍溫度差異。同時，在滴凍前要使精液和接觸精液的器皿如滴管、小試管等，保持同一溫度0～5 ℃。精液在滴凍前要混合均勻，使滴凍出的顆粒精子密度均勻。在滴凍過程中要迅速滴凍，滴凍結(jié)束后容器需加蓋，以減少在外界氣溫下的暴露時間，確保冷凍效果。

5解凍溫度與解凍方法的影響

精液解凍相對冷凍來說方法比較簡單速度快，但不能說解凍不重要。牛精子的危險區(qū)域是0～-60 ℃，所以要以最快的速度越過這個區(qū)域，使精子不至于受到傷害，這是解凍中要解決的一個關(guān)鍵問題。目前世界各國所采用的解凍溫度不盡相同，通常采用的溫度有快速(40 ℃)，室溫(15～20 ℃)和冷水(4～5 ℃)緩慢解凍三種。我國當前多采用35～40 ℃水浴快速解凍的方法。還有些試驗結(jié)果表明，用75 ℃ 12 s，95 ℃ 7 s，98 ℃5 s瞬間解凍0.5 mL細管精液或用100～135 ℃ 5 s解凍0.25 mL細管精液，解凍后活率高，頂體完整率可達76%，明顯高于35～40 ℃下解凍的精液，而75 ℃與90 ℃相比較無差異。盡管解凍溫度越高，解凍速度越快，越過危險區(qū)的時間就越短，但是生產(chǎn)實踐中還有一個經(jīng)驗的問題，精子處于高溫下時間過長，容易使精子在短時間內(nèi)的能量耗盡，而時間短了達不到解凍的目的。因此高溫快速解凍多數(shù)只是在實驗室中進行，在生產(chǎn)上還未得到普遍采用。

對于顆粒凍精的解凍，由于精液在冷凍前稀釋倍數(shù)較低，解凍時需加解凍液，解凍液一般用0.9%的檸檬酸鈉液，把1～1.5 mL的檸檬酸鈉液滴入小試管中，然后把小試管放在40 ℃的溫水中預熱，將顆粒凍精從液氮中取出立即投入小試管中輕搖，待融化到2/3時，從溫水中取出，繼續(xù)搖動使其全部融化。

精液解凍后使用時間，細管為1 h(上限)，顆粒為2 h(上限)。如解凍后需外運時，可采取低溫10～15 ℃解凍，然后用脫脂棉或多層紗布包裹，再用塑料袋包好，置4～5 ℃的環(huán)境中儲存，其使用時間可達8 h。

實踐證明，冷凍精液在室溫中停留過久(超過10 s)精子的活力會降低。因此，在解凍前后取放精液時，動作盡量迅速、減少在空氣中停留的時間，若停留時間過長中途要放回液氮中冷卻一會兒再接著操作。

6討論

在實踐中掌握和運用熟練的采精技術(shù)，了解個體采精特點，正確掌握種公牛的采精頻率，同時做好夏季防熱避暑工作，為種公牛創(chuàng)造比較舒適的環(huán)境，是充分發(fā)揮其生產(chǎn)潛力，使其提供數(shù)量多、質(zhì)量好凍精產(chǎn)品的重要措施。

稀釋精液不能沒有甘油，但又要越少越好，目前一般為5%～7%。但有資料證明3.3%的甘油含量效果最佳。在降低稀釋液中甘油濃度的情況下，提高凍精質(zhì)量而又不至于使程序復雜化，還有待于進一步研究。

當初凍溫度為-110 ℃～-120 ℃，冷凍細管距液氫面高度4 cm，冷凍數(shù)量200～250支細管精液時，凍后活力可達0.45，經(jīng)生產(chǎn)推廣應(yīng)用效果頗佳。但也存在一些問題，操作存在一定的誤差，特別是初凍溫度不易控制一致。要想解決這些問題，需要生產(chǎn)出更先進的冷凍設(shè)備。

制作凍精是工作的關(guān)鍵，但沒有優(yōu)質(zhì)的解凍液和正確的解凍方法，效果同樣不理想。試驗中溫度越高，解凍速度越快，但是這個溫度很難把握，就會使還未進入子宮的精子能量消耗殆盡。所以實際生產(chǎn)中，解凍溫度控制在40±2 ℃為宜。用維生素B12作顆粒凍精解凍液，解凍后精子活力提高，活力下降速度緩慢，人工授精受胎率明顯提高，可進一步推廣應(yīng)用于生產(chǎn)中。

7參考文獻

[1]李英茹.淺談凍精制作中影響精子生命的幾個環(huán)節(jié)[J].黃牛雜志，1，49，65.

[2]王書芳，耿方閣.影響種公牛凍精生產(chǎn)若干因素的探討[J].中國畜牧雜志，3，36～38.

[3]劉彩蘭.談牛冷凍精液質(zhì)量檢測技術(shù)問題[J].中國奶牛，1997，3，35～36.

[4]王宏斌，劉國齡.牛的塑料細管冷凍精液試驗研究[J].草食家畜，1995，4，31～34.

[5]張揚，高粱，宋飛,等.用VB12作顆粒凍精解凍液提高母牛冷配受胎率的研究[J].草食家畜，1997，2，33～34.

[6]沙哈提.巴依頂.如何提高牛的冷凍精液受胎率[J].草食家畜，1998.1.26～28.

[7]張堅中.家畜冷凍精液，1998，143～145.

[8]王光興，閻玉琴，朝兆玉.牛冷凍精液解凍后在不同溫度下的存活時間[J].黑龍江動物繁殖，1995，3，12～14.

[9]淵錫藩，張一玲，邢小軍,等.影響精液質(zhì)量的幾個冷凍技術(shù)因素[J].畜牧獸醫(yī)報，1995，225～230.

[10]瞿伯以.關(guān)于冷凍精液的解凍問題，楊學時，周廣鋪編，全國牛冷凍精液國家標準培訓班技術(shù)輔導教材，1985，183～188.

[11]S.D.Singh.快速冷凍和解凍對牛精子酶類泄漏的影響[J].國外畜牧學-草食家畜，1990，5，31～32.

[12]B.A.ByPob.公牛精子存活時間的快速測定法[J].國外畜牧學-草食動物，1986，257.

作者簡介：韓星(1971-)，男，大專，助理畜牧師。

收稿日期：2016-01-11

中圖分類號：S823.3

文獻標識碼：B

文章編號：1005-2739(2016)02-0061-04