杜仲生物技術(shù)育種研究進(jìn)展

劉慧敏， 杜紅巖， 烏云塔娜

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心， 河南 鄭州 450003；2.國家林業(yè)局 杜仲工程技術(shù)研究中心， 河南 鄭州 450003)

杜仲生物技術(shù)育種研究進(jìn)展

劉慧敏1，2， 杜紅巖1，2， 烏云塔娜1，2

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心， 河南 鄭州 450003；2.國家林業(yè)局 杜仲工程技術(shù)研究中心， 河南 鄭州 450003)

從杜仲組織培養(yǎng)、遺傳多樣性、性別相關(guān)分子標(biāo)記、全基因組測序及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、功能基因和轉(zhuǎn)基因方面對杜仲生物技術(shù)育種研究進(jìn)展總結(jié)了杜仲生物技術(shù)育種研究進(jìn)展，并指出了存在的問題及今后的發(fā)展方向。

杜仲； 生物技術(shù)； 育種； 進(jìn)展

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)屬于杜仲科，該科僅1屬1種。杜仲樹皮作為傳統(tǒng)的中藥材已有2 000多年的歷史，有很高的經(jīng)濟(jì)價值，其主要藥理功能為降血壓、強(qiáng)筋骨、增強(qiáng)肝腎功能和安胎[1-3]。除去木質(zhì)部，杜仲全株都含有白色絲狀物質(zhì)—杜仲膠，是天然橡膠的同分異構(gòu)體，為重要的化工原料。此外，由于杜仲適生范圍廣，病蟲害少，也是很好的園林綠化及水土保持樹種，具有較高的生態(tài)效益。

隨著生物技術(shù)在林木上的發(fā)展，我國已有20多種林木轉(zhuǎn)基因成功[4]。杜仲的常規(guī)育種已取得了較大的進(jìn)展，為了加快杜仲優(yōu)良品種的育種進(jìn)程，本文綜述了杜仲的生物技術(shù)育種研究成果，以期為常規(guī)育種與分子育種相結(jié)合提供理論參考。

1 杜仲組織培養(yǎng)

杜仲的組織培養(yǎng)研究始于20世紀(jì)80年代，左春芬[5]等用杜仲幼嫩樹枝誘導(dǎo)出愈傷組織。Zhang[6-7]利用杜仲未成熟的木質(zhì)部和韌皮部離體培養(yǎng)出愈傷組織。1988年，張朝成[8]首次報道了用杜仲腋芽作為外植體培養(yǎng)出完整的植株。同年，芮和愷[9]將杜仲下胚軸離體培養(yǎng)出愈傷組織，并誘導(dǎo)其分化出芽。王秀松[10]等于1994年采用杜仲下胚軸和子葉誘導(dǎo)得到了大量的胚性愈傷組織并再生了小植株。 90年代的科研工作者相繼進(jìn)行了以杜仲莖尖、枝條為外植體的微繁研究[11-13]，愈傷組織的超低溫保存[14]，以及愈傷組織中有效成分及膠含量的測定[15-17]。21世紀(jì)至今，科研工作者在前人研究的基礎(chǔ)上對杜仲的組織培養(yǎng)做了更深入和全面的研究，蔣祥娥[18]等發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺能促進(jìn)培養(yǎng)基中不定芽的分化。李琰[19-21]等研究了外植體的種類、大小和采樣時間，試驗(yàn)接種方式，光照條件，培養(yǎng)基pH值，以及植物生長調(diào)節(jié)劑對杜仲愈傷組織和叢生芽的誘導(dǎo)等。邱曉芳[22]建立了杜仲的搖瓶懸浮培養(yǎng)體系，并測定了培養(yǎng)過程中主要次生代謝物的含量。李俊紅[23]以幼嫩葉片為外植體，對杜仲再生體系進(jìn)行了優(yōu)化并用秋水仙素誘導(dǎo)出43株多倍體植株。 2010年，唐亮[24]以杜仲的成熟胚為外植體通過直接和間接器官發(fā)生途徑均獲得了杜仲的再生植株，研究了其生根、煉苗和移栽過程，并以未成熟胚為外植體，獲得了胚性愈傷組織。王征[25]在唐亮的研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了杜仲組織培養(yǎng)體系，建立了以愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽、壯苗生根路線為基礎(chǔ)的植株再生體系。日本學(xué)者報道了利用杜仲的下胚軸高效地培養(yǎng)出杜仲的再生植株[26]。

盡管前人已經(jīng)做過很多研究，目前杜仲組織培養(yǎng)仍然存在一些問題，在其初代培養(yǎng)時污染率相對較高，芽的誘導(dǎo)率低[27]。由于杜仲的胚狀體發(fā)生體系還未建立，因此通過胚狀體途徑育苗并將其工廠化仍需科研工作者進(jìn)行更多的探索。

2 杜仲遺傳多樣性研究

遺傳多樣性是保護(hù)生物學(xué)研究的核心之一，了解物種的遺傳多樣性對制定長期保護(hù)策略、育種和性狀的改良都有重要的意義。杜仲的遺傳多樣性研究最初是由張?zhí)碵28]等對采自貴州、陜西等地的38個杜仲的無性系進(jìn)行的酯酶同工酶分析。之后，郭軍戰(zhàn)[29]于1996年根據(jù)當(dāng)時杜仲資源利用的現(xiàn)狀，提出了杜仲遺傳多樣性保護(hù)的意義和途徑，并分析了杜仲育種的多目標(biāo)特征和主要育種方式。21世紀(jì)隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展，我國的科研工作者相繼建立了RAPD、ISSR、SSR、ScoT等分子標(biāo)記反應(yīng)體系[30-35]，研究了杜仲的遺傳多樣性，為分子標(biāo)記輔助育種的技術(shù)在杜仲育種研究中的應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。武漢植物園先后用cpSSR、AFLP和SSR研究了全國范圍杜仲9個栽培群體和一個半野生群體共582分樣品的遺傳多樣性[36-37]，結(jié)果表明，杜仲群體間的遺傳多樣性較群體內(nèi)的遺傳多樣性低，表明杜仲群體間的基因交流較頻繁，半野生狀態(tài)下的神農(nóng)架群體的遺傳多樣性高于其他栽培群體，表明人為活動降低了杜仲的遺傳多樣性，貴州遵義群體的遺傳背景較為單一，應(yīng)該優(yōu)先保護(hù)。其他基于EST _SSR和基于全基因組的SSR[38-39]等分子標(biāo)記對全國杜仲遺傳多樣性的結(jié)果均表明杜仲群體間的基因交流比較頻繁，與武漢植物園的結(jié)果一致。

以上杜仲的遺傳多樣性分析表明我國杜仲資源混雜，遺傳多樣性較低，應(yīng)結(jié)合形態(tài)指標(biāo)及生理特性研究，提出杜仲的保護(hù)策略，建立杜仲核心種質(zhì)資源庫，并加強(qiáng)對遺傳背景較單一地區(qū)杜仲的保護(hù)和半野生杜仲群體的深入研究，從而挖掘優(yōu)良的基因資源。

3 杜仲性別相關(guān)分析標(biāo)記

杜仲為嚴(yán)格的雌雄異株植物，在幼年期僅憑形態(tài)指標(biāo)難以鑒定其性別，開發(fā)杜仲性別相關(guān)的分子標(biāo)記能夠?yàn)槎胖俜N質(zhì)資源在幼苗時期的合理配置提供理論依據(jù)，并為生產(chǎn)實(shí)踐提供指導(dǎo)。WenJie Xu[40]發(fā)現(xiàn)了一段569 bp的RAPD標(biāo)記僅存在于雌株，用Southern印記雜交做了驗(yàn)證，將其測序后設(shè)計(jì)了特異引物，合成能鑒別雌株的SCAR標(biāo)記。Da-Wei Wang[41]利用64對AFLP引物組合發(fā)現(xiàn)一段350 bp的雄性特異引物，并將其轉(zhuǎn)化為一段247 bp的SCAR引物，能夠特異鑒別出雄性植株。安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)建立了杜仲ISSR-PCR反應(yīng)體系[42]，并擴(kuò)增出一條3000 bp的雌性特異性條帶。以上研究為杜仲苗期性別選擇提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)，能夠大幅提高育種效率。

4 杜仲全基因組測序及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

中國林科院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心于2014年完成了杜仲全基因組精細(xì)圖的繪制，是我國第一個天然橡膠植物和世界上第一個木本藥用植物的基因組精細(xì)圖。西北農(nóng)林科技大學(xué)[43]利用AFLP標(biāo)記技術(shù)和擬測交作圖策略，以人工雜交獲得的F1作圖群體為材料，構(gòu)建出杜仲的首張遺傳圖譜，親本Q1遺傳連鎖群包含12個連鎖群，覆蓋基因組總長929.57 cm，平均間距8.61 cm，親本LF遺傳連鎖圖含有14個連鎖群，覆蓋基因組總長約1116.08 cm，平均間距8.78 cm。并對重要數(shù)量性狀進(jìn)行了QTLs分析，找出控制杜仲葉片性狀、生長性狀與性別決定相關(guān)的分子標(biāo)記，共檢測到控制8個性狀的29個QTL位點(diǎn)，兩個與杜仲雄性相關(guān)的分子標(biāo)記。杜仲全基因組物理圖譜和遺傳圖譜的完成是杜仲研究里程碑式的進(jìn)步，將對杜仲和其他藥用木本植物的遺傳改良、基礎(chǔ)生物學(xué)和進(jìn)化研究發(fā)揮重要的推動作用。

5 杜仲功能基因研究

隨著二代測序高通量低成本的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序成為了解一個物種基因信息的快速有效的手段。中南林業(yè)科技大學(xué)和中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究中心完成了杜仲果實(shí)和葉片的轉(zhuǎn)錄組測序，通過生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合，研究了杜仲M(fèi)EP途徑[44-45]、MVA途徑[46]、橡膠合成[47]、綠原酸生物合成[48]、黃酮類生物合成[49]、a-亞麻酸生物合成[50]相關(guān)的基因特征及表達(dá)模式。貴州大學(xué)構(gòu)建了杜仲樹皮的cDNA文庫[51]，并在此基礎(chǔ)上克隆了EuFLC1、EuCGT1和EuCAD基因并進(jìn)行了序列分析[52-54]。

國外研究者也做了相關(guān)的研究，Ren Chen[55-56]通過在杜仲不定根中過表達(dá)IPPI和FPPS1基因，從10個候選看家基因中篩選出能夠衡量IPPI和FPPS1表達(dá)量變化的兩個最優(yōu)看家基因ACTα和EF1α，并發(fā)現(xiàn)過表達(dá)IPI基因，不定根中的反式聚異戊二烯的含量有明顯的提高。Nobuaki[57]構(gòu)建了杜仲莖外周組織和內(nèi)周組織cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)了與膠合成相關(guān)的同源基因，并通過酵母突變體驗(yàn)證了6條參與MVA途徑的基因的功能。

6 杜仲轉(zhuǎn)基因研究

功能基因的發(fā)掘?yàn)槎胖俚霓D(zhuǎn)基因育種奠定了基礎(chǔ)，近年來國內(nèi)外科研工作者也進(jìn)行了杜仲的轉(zhuǎn)基因研究。貴州大學(xué)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將EuFPS基因?qū)攵胖僦?，并研究了ipt基因?qū)Χ胖龠z傳轉(zhuǎn)化的影響[58-59]。中南林業(yè)科技大學(xué)[47]通過在杜仲樹皮中過表達(dá)EuTIDS5和RNAi干擾EuTIDS5表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)處理比對照膠絲增多2.5倍，RNAi處理的膠絲僅為對照的1/2，認(rèn)為EuTIDS5為杜仲橡膠合成關(guān)鍵酶基因。

7 存在的問題及展望

如上所述，杜仲生物技術(shù)育種研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但仍存在著一些問題：(1)在杜仲遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)和離體胚培養(yǎng)等的研究利用方面，仍未建立起一套可操作性強(qiáng)、行之有效的技術(shù)體系。(2)缺乏基因的高效發(fā)掘技術(shù)，實(shí)用分子標(biāo)記較少，許多重要目標(biāo)性狀基因尚需緊密標(biāo)記，還缺乏品質(zhì)、產(chǎn)量、抗性等協(xié)調(diào)改良的高效育種技術(shù)。

今后的杜仲育種工作應(yīng)加強(qiáng)常規(guī)雜交育種技術(shù)與現(xiàn)代生物技術(shù)的有機(jī)結(jié)合。提高杜仲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、離體胚培養(yǎng)等技術(shù)的效率。在杜仲全基因組測序的基礎(chǔ)上高效挖掘目標(biāo)性狀基因，構(gòu)建密度更大的遺傳圖譜，對重要性狀進(jìn)行精細(xì)定位，開發(fā)實(shí)用分子標(biāo)記，進(jìn)行杜仲經(jīng)濟(jì)性狀的早期選擇從而提高育種效率。提高杜仲轉(zhuǎn)基因的效率，并加強(qiáng)其可操作性。

總之，隨著杜仲產(chǎn)品的開發(fā)利用，對其進(jìn)行多目標(biāo)育種。應(yīng)根據(jù)不同的育種目標(biāo)，緊密結(jié)合常規(guī)育種和生物技術(shù)育種技術(shù)，選育出具有更多具有廣闊化市場前景的優(yōu)良品種。

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[57] Nobuaki Suzuki， Hirotaka Uefuji， Takashi Nishikawa， et.al. Construction and analysis of EST librabies of the trans-polyisoprene producing plant，Eucommia ulmoides Oliver [J].Planta，2012，236：1405-1417.

[58] 趙丹，趙德剛，李巖.EuFPS基因表達(dá)載體構(gòu)建及對杜仲遺傳轉(zhuǎn)化的研究[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28(1)：27-33.

[59] 李巖，趙德剛.Ipt基因促進(jìn)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化不定芽再生[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，33(6)：90-93.

AdvancesinresearchonbiotechnologybreedingofEucommiaulmoides

LIU Huimin1，2， DU Hongyan1，2， WUYUN Tana1，2

(1.Non-timber Research and Development Center of CAF， Zheng zhou 450003， China； 2.The Eucommia Engineering Research Center of State Forestry Administration， Zheng zhou 450003， China)

The present situation，limitation，and outlook in research on biotechnology breeding concluding tissue culture，genetic diversity，sex-linked marker，whole genome sequencing，genetic linkage map，functional gene，and transgene were summarized in this article.This paper also offered a basic reference for the combination of conventional and molecular breeding ofEucommiaulmoides.

Eucommiaulmoides； biotechnology； breeding； advance

2016-01-27

國家十二五科技支撐計(jì)劃(2012BAD21B0502)。

劉慧敏(1989-)，女，河南省輝縣市人，博士研究生，研究方向?yàn)榱帜具z傳育種。

烏云塔娜(1975-)，女，內(nèi)蒙古通遼市人，教授，主要從事經(jīng)濟(jì)林育種與栽培的研究。E-mail：tanatana@163.com.

Q 949.751.5； S 336

A

1003 — 5710(2016)02 — 0132 — 05

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2016. 02. 025

(文字編校：楊 駿)