微小RNAs在宮頸癌中的異常表達分析

屈建花，曹文君，苗聰秀

·綜述·

微小RNAs在宮頸癌中的異常表達分析

屈建花，曹文君，苗聰秀△

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是現(xiàn)今腫瘤學研究的熱點，與包括宮頸癌在內的多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移密切有關，有關miRNAs與宮頸癌關系的研究日益增多。研究發(fā)現(xiàn)，有些機制能引起miRNAs異常表達，且異常表達的miRNAs通過影響重要的調節(jié)基因促進宮頸癌的發(fā)生，在宮頸腫瘤的惡性轉化過程中有重要作用。本文就宮頸癌中miRNAs異常表達的可能機制及其在宮頸癌不同生物學階段的作用進行綜述。

微RNAs；基因表達；宮頸腫瘤；癌

【Abstract】MicroRNAs（miRNAs）have become the center of interest in oncology and are closely associated with a variety of tumors including the occurrence，development，invasion and metastasis of cervical cancer.Great concern has been raised regarding the correlation between cervical cancer and miRNAs.Studies demonstrated that some mechanisms could cause aberrant expressions of miRNAs.MiRNAs regulate gene expression by influencing important regulatory genes and thus are responsible for causing cervical cancer which plays a key role in malignant transformation of cervical cancer.In this paper，the pathogenesis of miRNAs dysregulation in different stages of cervical cancer are reviewed.

【Keywords】MicroRNAs；Gene expression；Uterine cervical neoplasms；Carcinoma （J Int Obstet Gynecol，2016，43：424-427）

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一種長約17～22個核苷酸的非編碼單鏈RNA，1993年首次由Lee等從秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)。miRNAs通過切割mRNA和抑制mRNA翻譯來調控基因表達，在人類發(fā)展中起重要作用［1］。研究表明，miRNAs的異常表達與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及預后有密切關系，染色體的異常改變、DNA甲基化、miRNAs或其結合位點多態(tài)性、轉錄因子異常調控可能導致miRNAs異常改變，從而影響原癌基因或抑癌基因，改變宮頸癌細胞生長、侵襲及轉移潛能。約1％～2％的人類基因編碼miRNAs。成熟的miRNAs來源于miRNAs前體（primiRNAs），編碼該前體的序列可能位于核DNA的不同部位，組成單或多順反子轉錄單位，也可能位于內含子、外顯子或編碼蛋白基因。

宮頸癌由宮頸上皮內瘤變發(fā)展而來，病理類型主要為鱗狀細胞癌（75％～85％）、腺癌（20％～25％）和腺鱗癌（3％～5％），幾乎所有流行病學資料結合實驗室的數據都強有力地支持高危型人乳頭瘤病毒（HPV）持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件。近年來宮頸癌中異常表達的miRNAs，靶基因預測，作用機制及其在宮頸癌起始、發(fā)生、發(fā)展不同階段的作用備受關注。

1　宮頸癌中miRNAs異常表達的可能機制

一些機制能引起miRNAs的表達異常，而這些異常又會進一步導致包括腫瘤在內的疾病發(fā)生。導致miRNAs異常表達的原因包括miRNAs位點刪除或擴增、DNA甲基化、miRNAs及miRNAs靶位點多態(tài)性、轉錄因子異常調控。

1.1宮頸癌中miRNA位點刪除或擴增轉錄miRNAs的基因常位于斷裂點區(qū)、雜合性丟失（LOH）最小區(qū)和脆性位點。因此，染色體改變被認為是惡性腫瘤中引起miRNAs異常表達的主要原因。LOH在包括宮頸癌在內的多種惡性腫瘤的早期發(fā)展過程中十分普遍。在宮頸癌中位于11q24.1的miR-100表達水平下調，11q23.3～11q24.1區(qū)域與LOH有關，推測LOH可能導致miR-100表達水平下調。腫瘤形成過程中基因活化的其他機制有染色體獲得和擴增。例如宮頸癌組織特異表達的miR-944位于宮頸癌中經常被擴增的染色體片段3q27～28。研究發(fā)現(xiàn)miR-9（1q23.2）、miR-15b（3q25.32）、miR-28-5p （3q27.3）、miR-100、miR-125b（11q24.1） 這 5種miRNAs與染色體改變有關，進一步分析發(fā)現(xiàn)染色體1q突變可能與miR-9的上調有關。宮頸癌中Drosha的高表達會影響整體miRNAs的表達，染色體5p突變與miRNA處理酶Drosha的高表達及miRNA的表達譜有關。Drosha過表達被認為是宮頸癌后期進展的主要機制之一，即過表達的Drosha會增加成熟miRNAs的表達水平，而這反過來又會影響mRNA的轉錄和其他pri-miRNAs的產物。

1.2宮頸癌中miRNA表觀遺傳調控DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，抑制基因表達，進而改變其表型。研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳改變參與宮頸癌形成。Wilting等［2］發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織中，miR-203、miR-375的CpG島甲基化明顯，而miR-203、miR-375的表達下調，進一步添加去甲基化試劑可使miRNAs表達復活，提示miR-203、miR-375的CpG島高甲基化是miR-203、miR-375下調的主要機制。Campos-Viguri等［3］用5-氮雜-2′-脫氧胞苷處理HeLa、SiHa、CaSki和C33A細胞，使miR-23b啟動子區(qū)甲基化，結果發(fā)現(xiàn)miR-23b的表達升高，表明miR-23b的表達水平受其啟動子甲基化調控。由HPV導致宮頸惡變過程中的不同時期，甲基化水平的miR-149、miR-203、miR-375的表達增加。在宮頸癌細胞系發(fā)現(xiàn)，多種miRNAs的甲基化（如miR-432、miR-1286、miR-641、miR-1290、miR-1287、miR-95）與HPV感染有關。因此，異常的DNA甲基化在宮頸癌中調控miRNA表達有重要作用。

1.3宮頸癌中miRNAs及miRNAs靶位點多態(tài)性研究表明，編碼蛋白或miRNAs的基因或miRNAs靶向基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）會改變miRNAs的表達和（或）成熟，而此與惡性腫瘤生長有關。PrimiR-218（rs11134527）的多態(tài)性導致miR-218的表達改變，進而影響miRNA結合過程，從而增加宮頸癌的易感性［4］。hsa-miR-499（rs3746444A/G）和hsamiR-146a（rs2910164G/C）的多態(tài)性與宮頸鱗癌有關。miR-146a（rs2910164）通過提高成熟miR-146a的表達水平來影響中國人群對宮頸癌的基因易感性。Meta分析發(fā)現(xiàn)，miR-124（rs531564C＞G）的多態(tài)性，是中國人群對包括宮頸癌在內眾多惡性腫瘤的危險因素，多項研究則發(fā)現(xiàn)，miR-124多態(tài)性與其基因多態(tài)性有關［5］。miRNAs靶向結合位點多態(tài)性也會改變罹患宮頸癌的風險。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2的miRNA靶向結合位點C到T的多態(tài)性與宮頸腫瘤的形成有關。Pri-miR-218（rs11134527，A/G） 和 LAMB3 （rs2566，C/T）的多態(tài)性分別會減少或增加宮頸癌的發(fā)病率。SNP與宮頸癌的關系及可能的生物機制尚需進一步研究來闡明。

1.4宮頸癌中miRNAs的轉錄因子調控基因表達受轉錄因子和靶基因上游調控元件的調控［6］。轉錄因子作為miRNA調節(jié)因子，可激活或抑制miRNA表達。轉錄因子活動改變會導致miRNA表達改變。Mao等［7］研究發(fā)現(xiàn)，轉錄因子KLF4（Krueppel-like factor 4）激活miR-544啟動子區(qū)，從而上調宮頸癌miR-544表達水平。目前轉錄因子調控miRNAs表達的研究較少。

2　宮頸癌不同生物學階段miRNAs的作用

研究表明，miRNAs在凋亡、細胞周期、侵襲和轉移的生理學過程中發(fā)揮不同作用。

2.1凋亡凋亡在正常生理過程和宮頸組織中有重要作用。2003年首次報道m(xù)iR-14在果蠅中調控凋亡。凋亡受多種蛋白調控。Bcl-2家族由多種蛋白組成，是凋亡途徑中的重要因子，可分為3個功能組，Ⅰ組由Bcl-2和Bcl-xL組成，起抗凋亡作用；Ⅱ組由Bax和Bak組成，起促凋亡作用；Ⅲ組由Bim和Bad組成，也起促凋亡作用。Liu等［8］發(fā)現(xiàn)miR-143過表達會促進凋亡，抑制HeLa細胞生長，而抗miR-143將會解除這一效應。miR-143抑制攜帶Bcl-2的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）的熒光素酶報告基因活動，一旦miR-143靶向結合位點突變，這一抑制效應也會消失，說明Bcl-2是miR-143的靶基因，miR-143通過間接靶向作用于Bcl-2來抗凋亡，是一個抗凋亡因子。miR-886-5p在宮頸癌中上調，靶向作用于Bax蛋白。Bax和（或）Bak蛋白破壞線粒體外膜，致細胞色素釋放，激活caspase（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶），激活的caspase-9導致細胞最終死亡。

宮頸癌中最被認可的抑制凋亡途徑是蛋白激酶B（AKT）信號通路。有研究報道，miR-218通過抑制AKT-mTOR信號通路來抑制宮頸癌細胞生長，同時還會減少HeLa細胞中Rictor和磷酸化AKT水平［9］。因此推測miR-218靶向作用于mTOR成分Rictor后，阻斷AKT磷酸化。Cong等［10］發(fā)現(xiàn)miR-634在宮頸癌組織中表達異常增加，證實miR-634可靶向結合mTOR mRNA 3′-UTR，負性調控mTOR基因表達，誘導宮頸癌細胞凋亡。

2.2細胞周期調控正常細胞生長受細胞周期蛋白的調控，調控失常會導致細胞無限生長而發(fā)展為惡性腫瘤。周期蛋白依賴性激酶（CDK）途徑在細胞周期調控中起主要作用，宮頸癌中此途徑受多種miRNAs調控。miR-29a與CDK6呈負相關。CDK6在G1期呈活化狀態(tài)，且活性依賴于細胞周期蛋白D1 （cyclinD1）。G1向S期轉化前期，cyclinD1水平升高。miR-29a低表達導致cyclinD1和CDK6轉錄物高表達，形成大量cyclinD1/CDK6復合物，進而導致Rb不受限制的磷酸化，從而使細胞無限增殖形成惡性腫瘤。Wang等［11］發(fā)現(xiàn)，miR-195在早期宮頸癌組織呈低表達，miR-195可靶向作用于cyclinD1a mRNA 的3′-UTR來調控cyclinD1表達水平，抑制癌細胞增殖。miR-214間接靶向作用于cyclinD1。研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌中miR-214下調，其靶向作用于c-Jun氨基端激酶1（JNK1）的3′-UTR。JNK1靶向作用于調控增殖的活化蛋白轉錄因子組成員，進而調控包括增殖在內的多種生物活動?；罨腏NK1誘導c-Myc，而c-Myc能抑制p21表達，通過cyclinD1表達來促進細胞增殖。JNK1也可下調c-Jun，而c-Jun則抑制p53表達。miR-372通過靶向作用于 CDK2和cyclinA1來控制細胞周期。CyclinA1先與CDK2結合，促使DNA復制，隨后再與CDK1結合促進有絲分裂。

p53是一種腫瘤抑制蛋白，在調控細胞增殖中起重要作用。YY1（Yin Yang 1）屬于鋅指結構的一種轉錄因子，調控細胞生長及分化，在人類多種惡性腫瘤中起致癌基因作用。由YY1、MDM-2、p53組成的三元復合物將p53運輸到蛋白酶體，p53在此被降解。YY1過表達將會導致p53水平降低。Zhou等［12］發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中miR-181與YY1的表達呈負相關，miR-181可靶向作用于YY1抑制腫瘤生長。

在癌細胞中，有絲分裂激酶的過表達會忽略檢測點。PLK1（pole like kinase 1）是G2/M轉化期一個重要的檢測點，在宮頸癌中miR-100靶向作用于PLK1。PLK1過表達會導致cyclinB1和Cdc25C過度活化，使細胞進入有絲分裂期。Xu等［13］發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中，細胞周期檢測點激酶1（Chk1）和p-Chk1的表達水平與miR-424呈負相關，過表達的miR-424會抑制Chk1，而RNA干擾介導的Chk1敲除會減少基質金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達。

叉頭框蛋白O1（FOXO1）是叉頭轉錄因子家族的重要組成部分。細胞中未磷酸化的活性形式FOXO1在細胞中表達增加，這與CDK抑制劑p27Kip1和p21Cip1的下調、轉錄和翻譯水平cyclinD1上調有關。宮頸癌細胞中，miR-223和miR-182直接作用于FOXO1，使得其表達下調［14］。miR-302-367下調cyclinD1和AKT1，上調p27Kip1和p21Cip1，進而抑制宮頸癌細胞的生長［15］。Xu等［16］通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)miR-135的下游靶目標是FOXO1，miR-135在宮頸癌細胞系中高表達，對宮頸癌細胞進行轉染，使miR-135表達下降，其FOXO1的表達水平也相應下調，宮頸癌細胞的增殖部分受到抑制，提示miR-135通過靶向作用于FOXO1，從而促進宮頸癌細胞生長。Hou等［17］發(fā)現(xiàn)，miR-196a在宮頸癌組織及細胞系中呈高表達，通過生物信息學和生物學方法證實miR-196a可靶向作用于FOXO1和p27Kip1，調控磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT信號通路，促進宮頸癌細胞增殖。

2.3宮頸癌轉移宮頸癌轉移，需突破上皮基底膜，此過程被稱為上皮間質轉化（EMT）。研究表明miRNAs參與宮頸癌的轉移過程。在宮頸癌組織中，miR-205通過EMT來抑制細胞轉移/侵襲［18］。富半胱氨酸蛋白（CYR61）和結締組織生長因子（CTGF）蛋白通過與細胞表面受體（如整合素蛋白受體和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）的相互作用在細胞增殖、黏附、轉移、血管生成和腫瘤形成中起重要作用。miR-205可靶向作用于CYR61和CTGF蛋白。miR-155的下調與宮頸癌的轉移/侵襲有關，miR-155抑制細胞信號轉導分子Smad2的表達，負性調控EMT，miR-155的過表達還會導致TP53的活化進而逆轉EMT。湯雅玲等［19］通過對50例宮頸癌患者腫瘤組織內miRNA-200c、ZEB1（宮頸癌EMT相關因子）水平進行分析，發(fā)現(xiàn)兩者表達水平呈負相關，提示EMT在宮頸癌的浸潤和轉移過程中起重要作用，而miRNA-200c可能對EMT起調節(jié)作用。

在侵襲過程中，MMPs在降解細胞外基質中起重要作用。細胞外基質是組織細胞外部分，介導細胞黏附。尿激酶纖溶酶原激活物（uPA）是一種絲氨酸蛋白酶，能將纖溶酶原激活為纖溶酶，同時也能激活MMPs，這使癌細胞能降解細胞周圍蛋白。HPV-16 E6蛋白能夠下調miR-23b，這會增加uPA的表達，從而誘導人類宮頸癌細胞的轉移。

其他研究發(fā)現(xiàn)，異常的糖基化作用在腫瘤的轉化、侵襲、轉移過程中起重要作用。miR-214在宮頸癌中表達下調。在糖基化作用中，N-乙酰半乳糖胺基轉移酶7（GALNT7）起催化作用，miR-214能夠靶向作用于GALNT7并抑制其表達來抑制宮頸細胞的生長［20］。宮頸腺癌中，LAMB3促進宮頸癌細胞的轉移和侵襲。Yamamoto等［21］發(fā)現(xiàn)，miR-218下調將會減少LAMB3的表達。Laminin-332是一個由 3條鏈（LAMA3，LAMB3，LAMC2）組成的異三聚體，在再生和修復過程中調控細胞轉移。宮頸病變中，Laminin-332能夠與許多細胞表面受體結合，被視為一種侵襲性標志。整合素是一種跨膜蛋白，能夠介導細胞內外的信號通路的轉導，從而調控癌細胞的細胞周期、細胞轉移、侵襲。

血管生成是惡性腫瘤轉移中一個必要的過程。血管生成因子如血管內皮生長因子（VEGF）可促進血管生成。Sp1將絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑與VEGF表達偶聯(lián)起來。研究發(fā)現(xiàn)miR-375靶向作用于SP1的3′-UTR來敲除SP1進而減少細胞轉移和侵襲性。上調的miR-375在宮頸癌中通過阻斷G1到S期的轉化來抑制細胞增殖。VEGF在血管生成方面起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)許多惡性腫瘤中，多種miRNAs的直接靶作用點是VEGF。尚需進一步研究闡明宮頸癌中miRNA靶向作用或參與VEGF介導的血管生成機制。

3　結語

眾多miRNAs被證實在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，并有望成為腫瘤相關的分子標記物和腫瘤治療的新靶點。近年來對于內源性小分子RNA的研究已取得令人矚目的成果，miRNAs血清監(jiān)測的簡便性及無創(chuàng)性，在腫瘤的篩查、診斷、治療及預后評估等多方面都有著廣闊的應用前景，為宮頸癌的診療提供了新思路。文獻報道與宮頸癌有關的miRNAs有200余種，確定的靶基因有40余種，miRNAs在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中影響各種不同的信號通路，這些機制的闡明能夠為宮頸癌的早期診斷、早期治療、判斷預后提供可靠的理論依據。相信隨著研究的進一步深入，miRNAs這一新興的分子標記物將對宮頸癌的早期診斷、防治起到重要的促進作用。

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［本文編輯王昕］

The Analysis of Dysregulated miRNAs Involved in Cervical Cancer

QU Jian-hua，CAO Wen-jun，MIAO Cong-xiu.Changzhi Medical College，Changzhi 046000，Shanxi Province，China

MIAO Cong-xiu，E-mail：lbmcxsz@163.com

山西省青年科技研究基金面上項目（2015021185）；長治醫(yī)學院科技創(chuàng)新團隊項目（CX201403）

046000長治醫(yī)學院

苗聰秀，E-mail：lbmcxsz@163.com

△審校者

2015-12-28）