Dickkopf-3蛋白在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血漿中的表達(dá)

李沭巖，張　磊，張愛華

?

·臨床研究·

Dickkopf-3蛋白在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血漿中的表達(dá)

李沭巖1，張磊2，張愛華3

Abstract

?AIM:To observe the effects of Dickkopf-3 (Dkk-3) in diabetic retinopathy (DR) circulating blood in patients with the expression level,the Dkk-3 development changes in the diabetic retinopathy of significance in the diagnosis of early DR.

?METHODS:Eighty-five type 2 diabetic patients,included the non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR) 23 patients,proliferative diabetic retinopathy,proliferative DR (PDR) in patients with 30 and non-diabetic retinopathy (NDR) with 32 cases.The same period of healthy physical examination was selected as control group (80 cases).Serum samples were collected,and the relative expression level of Dkk-3 was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) double antibody sandwich assay.The statistical differences were compared between groups.

?RESULTS:The plasma level of Dkk-3 (430.16±198.11pg/mL) in DR patients was significantly lower than that in healthy control group (627.48±294.45 pg/mL; P<0.05) and NDR patients (601.99±194.16 pg/mL; P<0.05).While there was no significant difference in Dkk-3 level between NDR and healthy control group (P=0.729).The level of PDR in patients with Dkk-3 (396.38±185.59 pg/mL) was lower than that of NPDR (538.82±187.20 pg/mL; P=0.002).

?CONCLUSION:The decrease of Dkk-3 level may be related to the occurrence and development of diabetic retinopathy,and there is a significant correlation with PDR.Circulating blood Dkk-3 protein in diabetic retinopathy has a certain differential efficacy,it is likely to become diabetic retinopathy patients peripheral blood test indicators.

目的：觀察Dickkopf-3在糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)患者循環(huán)血中的表達(dá)水平，研究Dickkopf-3在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展中的變化，探討其在糖尿病視網(wǎng)膜病變早期診斷中的意義。

方法：選擇2型糖尿病患者85例，其中非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative DR，NPDR)患者23例、增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative DR，PDR)患者30例及無視網(wǎng)膜病變(non-diabetic retinopathy，NDR)患者32例。選擇同期健康體檢者為對照組(80例)。收集血清樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)雙抗體夾心法檢測循環(huán)血中Dickkopf-3的相對表達(dá)水平，并比較各組血漿Dickkopf-3的水平。

結(jié)果：糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血漿Dickkopf-3平均含量為430.16±198.11pg/mL，明顯低于健康對照組(627.48±294.45pg/mL)及無視網(wǎng)膜病變患者(601.99±194.16pg/mL)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而無視網(wǎng)膜病變與健康對照組Dickkopf-3水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.729)；增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變患者Dickkopf-3的水平(396.38±185.59pg/mL)低于非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變患者(538.82±187.20pg/mL)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。

結(jié)論：Dickkopf-3蛋白水平降低可能與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，與增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變有顯著相關(guān)性。循環(huán)血中Dickkopf-3蛋白對糖尿病視網(wǎng)膜病變具備一定的鑒別效能，有可能成為糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血的檢測指標(biāo)。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；Dickkopf-3；循環(huán)血液

引用：李沭巖，張磊，張愛華.Dickkopf-3蛋白在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血漿中的表達(dá).國際眼科雜志2016;16(10):1891-1893

0　引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)的微血管并發(fā)癥，其致病機(jī)制十分復(fù)雜，視網(wǎng)膜微血管功能障礙是其主要的病變特征。它的病變可累及視網(wǎng)膜、玻璃體，可致牽拉性視網(wǎng)膜脫離出血和新生血管性青光眼以及虹膜紅變等嚴(yán)重并發(fā)癥。若不給予積極治療，可能迅速進(jìn)展為增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)，嚴(yán)重影響視力，通常預(yù)后不良[1-2]。近來有研究表明，Dickkopf-3(Dkk-3)與進(jìn)展中血管生長密度的上調(diào)及某些腫瘤生長轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。它是一種分泌性糖蛋白，是Dickkopf(Dkk)家族中的一員[3]，表現(xiàn)出一些與其他家族成員不相同的性質(zhì)，對其生物學(xué)功能至今仍然不十分清楚。以往關(guān)于Dkk-3的研究多局限于腫瘤發(fā)生與發(fā)展中的作用，隨著相關(guān)研究的逐步深入，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其作為分化因子參與腫瘤血管重塑，因而引起廣泛關(guān)注。因此本研究擬測定DR患者相關(guān)危險因素及Dkk-3的含量，就其差異性變化進(jìn)行深入探討，從而為臨床診斷提供理論依據(jù)。

1　對象和方法

1.1對象

1.1.1病例選擇選取2014-10/2015-10在我院門診就診的2型DM患者85例，其中男43例，女42例，年齡40～70(平均56.46±8.66)歲。選擇同時期健康體檢者為對照組(normal control，NC)80例，其中男44例，女36例，年齡60.24±10.85歲，雙眼散瞳檢查眼底為正常。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2002年制定的國際DR分級標(biāo)準(zhǔn)；空腹血糖控制在8mmol/L以下；簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：全身感染、腫瘤、合并腦出血或腦梗死、心肌梗死、酮癥酸中毒、風(fēng)濕結(jié)締組織病；屈光間質(zhì)明顯混濁、青光眼、其他的眼內(nèi)新生血管性疾病、眼部激光及手術(shù)史者；近期應(yīng)用腎毒性藥物；其他原因引起的視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜病變。

1.1.2分組方法根據(jù)散瞳后直接檢眼鏡、眼底照相或眼底熒光造影檢查，按照有無視網(wǎng)膜病變將患者分為三組：無明顯視網(wǎng)膜病變NDR(non-DR，NDR)、非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative DR，NPDR)、增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative DR，PDR)。NDR組32例，其中男13例，女19例，年齡35～65歲； DR組53例，其中男30例，女23例，年齡40～70歲，NPDR組23例，PDR組30例。各組間年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法標(biāo)本采集與測定：采用無抗凝劑干燥試管，抽取空腹靜脈血5mL。30min內(nèi)高速離心分離(4000r/min離心10min后，3000r/min離心15min)。外周血被分為兩層，即血漿層和血細(xì)胞層；取上清分裝于Ep管中，-80℃保存。使用血漿時，為避免多次反復(fù)凍融，于4℃融解備用。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)雙抗體夾心法測定，使用購買的Human-Dkk3 Quantikine ELISA試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行嚴(yán)格操作。

2　結(jié)果

健康對照組、NDR組和DR組血漿Dkk-3水平分別為627.48±294.45、601.99±194.16、430.16±198.11pg/mL。由于Dkk-3濃度均呈正態(tài)分布(Kolmogorov-Smimov檢驗(yàn)，P>0.05)，故這三組間Dkk-3水平的比較采用方差分析，結(jié)果顯示差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.637，P<0.01)。兩兩比較(采用Tamhane分析，方差不齊)的結(jié)果顯示，DR組的血漿Dkk-3水平低于健康對照組及NDR組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而Dkk-3水平在NDR組與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.729)。明顯視網(wǎng)膜病變中，增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變和非增殖期Dkk-3水平分別為396.38±185.592、538.82±187.20pg/mL，PDR組的血漿Dkk-3水平低于NPDR組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.466，P=0.002)。

3　討論

近年來，糖尿病患病率不斷增加，而DR作為糖尿病最常見和嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，給個人和社會都帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和社會負(fù)擔(dān)。初次診斷2型糖尿病的患者DR發(fā)生率就可達(dá)12.4%，病程≥15a視網(wǎng)膜病變的發(fā)生危險可高達(dá)78%[4-5]。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期干預(yù)，降低糖尿病人群的糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生幾率，減少其對人類健康的影響，降低國家經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已經(jīng)成為目前世界所面臨的新問題。但目前早期診治方法尚缺乏，深入研究DR潛在的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診治靶點(diǎn)迫在眉睫。

Dkk家族由Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3、Dkk-4和Dkk-3的相關(guān)蛋白Soggy(Sgy)組成，對細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、增殖、極性的控制有著非常重要的功能[6-7]。Wnt信號通路參與機(jī)體的多種病理生理過程，如調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和黏附，調(diào)控機(jī)體免疫及機(jī)體應(yīng)激等。眾多腫瘤的發(fā)生與其異常持續(xù)性激活相關(guān)，特別是上皮性腫瘤的發(fā)病過程。Wnt信號通路的異常激活可誘導(dǎo)包括VEGF、細(xì)胞間黏附分子、腫瘤壞死因子、IL-8、MMP-2、MMP-9等許多靶基因的表達(dá)[8]，它們與炎癥及新生血管形成有關(guān)，介導(dǎo)炎癥過程以及新生血管形成[9-10]。Dkk-3是Wnt信號通路的拮抗因子，是腫瘤抑制基因，位于人類染色體11p5.1的位點(diǎn)，全長約47 100bp，包含9個外顯子，2個啟動子，Dkk-3的起始密碼位于第2個外顯子上。Dkk-3位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，包含350個氨基酸，該基因所編碼的蛋白可以阻止Wnt信號傳導(dǎo)通路的途徑，其在很多腫瘤組織中的表達(dá)均下凋，如腎癌[11]、胃癌[12]和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[13]等。Dkk-3可能在腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移，以及在腫瘤治療與預(yù)后中均起著重要作用。近年有研究表明，在結(jié)直腸癌、胃癌[14]及其癌旁組織中，Dkk-3陽性樣本比陰性樣本的平均微血管計數(shù)明顯多，Dkk-3的表達(dá)陽性樣本中也增加，而在正常黏膜樣本微血管表現(xiàn)為Dkk-3陰性，從而推測Dkk-3可能是新生血管形成過程中的一種前血管源性蛋白，或者是一種標(biāo)記，標(biāo)記新生血管的形成[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，DR患者比健康對照組及無視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者組血漿Dkk-3濃度明顯降低。NC組和NDR組患者的Dkk-3水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。DR患者中，PDR組血漿Dkk-3水平要低于NPDR組。DR的基本病理學(xué)改變是新生血管的形成和血-視網(wǎng)膜屏障的破壞。PDR是DR的發(fā)展晚期，伴隨視網(wǎng)膜新生血管的形成，易導(dǎo)致玻璃體出血、視網(wǎng)膜脫離。本研究結(jié)果表明，Dkk-3的降低與糖尿病的發(fā)生無明顯關(guān)系，與PDR的發(fā)生有關(guān)，提示低水平的Dkk-3可能是PDR發(fā)生的高危因素。當(dāng)Dkk-3降低，糖尿病患者發(fā)生PDR的風(fēng)險升高，兩者有顯著的關(guān)聯(lián)性。這也說明Dkk-3的降低與眼內(nèi)新生血管的發(fā)生相關(guān)。而血漿中的Dkk-3水平的降低是如何參與PDR及新生血管形成，還有待進(jìn)一步的研究。

糖尿病視網(wǎng)膜病變是非常嚴(yán)重的致盲性眼病，早期的診斷、早期干預(yù)非常關(guān)鍵。Dkk-3的測定或許有助于糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期診斷及監(jiān)測病情的發(fā)展，或許可以成為一種理想的檢查糖尿病視網(wǎng)膜病變的輔助檢查方法。

1王寧利，李仕明，李文生.我國循證眼科的發(fā)展現(xiàn)狀、問題及對策.中華眼科雜志 2013；49(5):477-480

2張承芬.眼底病學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社 1998：701-702

3Krupnik VE，Sharp JD，Jiang C，et al.Functional and structural diversity of the human Dickkopf gene family.Gene 1999;238(2)：301-313

4Wilkinson CP，F(xiàn)erris FL 3rd，Klein RE，et al.Proposed international clinical diabetic Retinopathy and diabetic macular edema disease severity scales.Ophthalmology 2003；110(9):1677-1682

5Ding J，Zou Y，Liu N，et al.Strategies of digital fundus photography for screening diabetic retinopathy in a diabefie population in urban China.Ophthalmic Epidemiol 2012；19(6):414-419

6Veeck J，Dahl E.Targeting the Wnt pathway in cancer：the emerging role of Dickkopf-3.Biochim Biophys Acta 2012；1825(1)：18-28

7丁振，錢葉本，熊奇如，等.DKK-3和WIF-1基因啟動子甲基化狀態(tài)與肝細(xì)胞癌的關(guān)系研究.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志 2009；13(3)：12-15，20

8Masckauchan TN,Shawber CJ,Funahashi Y,et al.Wnt/beta-catenin signaling induces proliferation,survival and interleukin-8 in human endothelial cells.Angiogenesis 2005;8(1):43-51

9Zhou T,Hu Y,Chen Y,et al.The pathogenic role of the canonical Wnt pathway in age-related maculsr degeneration.Invest Ophthalmol Vis Sci 2010;51(9):4371-4379

10Wu B,Crampton SP,Hughes CC.Wnt signaling induces matrix metalloproteinase expression and regulates T cell transmigration.Immunity 2007;26(2):227-239

11Ueno K，Hirata H，Majid S,et al.Wnt antagonist DICKKOPF-3(Dkk-3) induces apoptosis in human renal cell carcinoma.Mol Carcinog 2011;50(6)：449-457

12徐小燕,夏蒲,邢亞楠,等.胃癌中REIC蛋白分泌水平及其增殖抑制作用研究.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志 2011;27(5):568-570

13De Brouwer S，mestdagh P，Lambertz I,et al.Dickkopf-3 is regulated by the MYCN-induced miR-17-92 cluster in neuroblastoma.Int J Cancer 2012;130(11)：2591-2598

14楊子榮,董衛(wèi)國,樊利芳,等.組織芯片檢測 Dickkopf-3在胃癌中的表達(dá)及臨床意義.中華消化雜志 2009;29(8)：571-573

15Zitt M，Untergasser G，Amberger A，et al.Dickkopf-3 as a new potential marker for neoangiogenesis in colorectal cancer：expression in cancer tissue and adjacent non-cancerous tissue.Dis Markers 2008;24(2)：101-109

Study on the expression of Dickkopf-3 protein in diabetic retinopathy

Shu-Yan Li1,Lei Zhang2,Ai-Hua Zhang3

Research Project for Rehabilitation of Disabled People in Shanghai (No.K2014011)

Lei Zhang.Department of Ophthalmology,the Seventh People’s Hospital of Shanghai,Shanghai 200137,China.apple_lsy@163.com

2016-06-12Accepted：2016-08-23

diabetic retinopathy; Dickkopf-3; circulating

上海市殘疾人康復(fù)科研項(xiàng)目資助課題(No.K2014011)

1(200090)中國上海市，同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院眼科；2(200137)中國上海市第七人民醫(yī)院眼科；3(201700)中國上海市青浦區(qū)中心醫(yī)院眼科

李沭巖，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：眼底病。

張磊，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主任，研究方向：眼底病的臨床與基礎(chǔ)研究.apple_lsy@163.com

2016-06-12

2016-08-23

1Department of Ophthalmology,Yangpu Hospital Affiliated to Medical College of Shanghai Tongji University,Shanghai 200090,China;2Department of Ophthalmology,the Seventh People’s Hospital of Shanghai,Shanghai 200137,China;3Department of Ophthalmology,Qingpu District Central Hospital of Shanghai,Shanghai 201700,China

Li SY,Zhang L,Zhang AH.Study on the expression of Dickkopf-3 protein in diabetic retinopathy.Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci) 2016;16(10):1891-1893

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.10.26