TCP復(fù)合BMP-2誘導(dǎo)hMSCs成骨分化的協(xié)調(diào)機(jī)制研究

李岢昕　徐　蘭　黎倬榜　劉也琴

(黑龍江省佳木斯大學(xué),黑龍江　佳木斯　154007)

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TCP復(fù)合BMP-2誘導(dǎo)hMSCs成骨分化的協(xié)調(diào)機(jī)制研究

李岢昕徐蘭黎倬榜劉也琴

(黑龍江省佳木斯大學(xué),黑龍江佳木斯154007)

目的探討TCP復(fù)合BMP-2誘導(dǎo)hMSCs成骨分化的協(xié)調(diào)機(jī)制。方法分別制備TCP支架及TCP復(fù)合BMP-2支架材料，自3名志愿者身上分離hMSCs進(jìn)行傳代擴(kuò)增，取第3代細(xì)胞接種備好的支架材料，在復(fù)合后的第1、3、7天測量ALP的活性并進(jìn)行比較。結(jié)果在復(fù)合后第1天，兩組間ALP活性值比較無明顯差異(P>0.05)；在復(fù)合后第3、7天兩組間ALP活性值比較差異顯著(P<0.05)；TCP與細(xì)胞培養(yǎng)組1、3、7天的ALP活性值差異不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TCP復(fù)合BMP-2與細(xì)胞培養(yǎng)組的1、3、7天的ALP活性值隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，逐漸升高。結(jié)論BMP-2能協(xié)調(diào)TCP促進(jìn)hMSCs的分化效應(yīng)，基因治療可能為骨骼疾病提供一種新的治療途徑。

TCP；BMP-2；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；機(jī)制研究

大量研究證實(shí)BMP-2在骨缺損修復(fù)過程中扮演著重要角色，但BMP的合成較少、體內(nèi)降解速度較快，存在一定的副作用[1]。因此臨床上研究將其與相應(yīng)的支架材料復(fù)合，能促進(jìn)成骨的生長，減輕毒副作用。本文研究TCP聯(lián)合BMP-2對hMSCs向成骨分化的影響，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，報(bào)道如下。

1　支架材料制備

TCP支架材料的制備：支架材料TCP由東南大學(xué)材料系提供，棍狀，4 mm×4 mm×12 mm 大小，孔隙率約 75%，孔徑約 200～300 μm。將材料以雙蒸水反復(fù)清洗，洗凈孔隙及表面的碎屑，干燥后備用。

TCP復(fù)合BMP-2材料制備：參照文獻(xiàn)，進(jìn)行TCP與BMP-2的復(fù)合(過程略)[2]。將支架于實(shí)驗(yàn)前放入24孔板中，使用α-MEM培養(yǎng)基浸泡過夜備用。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1hMSCs細(xì)胞培養(yǎng)

選取3名志愿者，均為股骨骨折患者，簽署知情同意書。穿刺分離骨髓人充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)，以α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)傳代，

2.2細(xì)胞復(fù)合支架材料制備

hMSCs傳代擴(kuò)增，取第3代細(xì)胞以1×107/mL 的細(xì)胞濃度接種在制備的支架材料進(jìn)行復(fù)合，每個(gè)支架滴加80 μL細(xì)胞，后將支架放入培養(yǎng)箱內(nèi)2 h，促進(jìn)細(xì)胞與支架黏附。

2.3堿性磷酸酶活性

在細(xì)胞與支架復(fù)合后的第1、3、7天定量檢測ALP活性。采用磷酸對硝基苯酯法(PNPP)檢測ALP活性。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)　果

經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，TCP單獨(dú)與細(xì)胞培養(yǎng)組的1、3、7的ALP活性值分別為(8.81±1.2)、(9.05±1.4)、(9.23±1.5) nmol/(mg·h-1)，各組間差異不顯著(P>0.05)；TCP復(fù)合BMP-2與細(xì)胞培養(yǎng)組的1、3、7天的ALP分別為(9.01±1.0)、(12.24±2.2)、(49.01±4.5) nmol/(mg·h-1)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，ALP活性逐漸升高；在復(fù)合后第1天，兩組間ALP活性值比較無明顯差異(P>0.05)；在復(fù)合后第3、7天兩組間ALP活性值比較差異顯著(P<0.05)。

4　討　論

hMSCs中ALP的活性能反映骨細(xì)胞的分化情況，本文選擇hMSCs作為研究載體，通過檢測TCP單獨(dú)、TCP復(fù)合BMP-2的生物復(fù)合材料與hMSCs共培養(yǎng)后ALP的活性，觀察TCP聯(lián)合BMP-2對hMSCs向成骨分化的影響，結(jié)果提示TCP單獨(dú)與細(xì)胞培養(yǎng)組1、3、7天的ALP活性值差異不顯著，TCP復(fù)合BMP-2與細(xì)胞培養(yǎng)組的1、3、7天的ALP活性值隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸升高，說明BMP-2復(fù)合TCP支架材料上hMSCs成骨分化良好，能促進(jìn)TCP復(fù)合hMSCs的成骨分化作用。在真空吸附條件下，BMP被吸入TCP微孔中保存，待hMSCs接種支架時(shí)，BMP直接作用誘導(dǎo)成骨，引導(dǎo)血管長入材料，為新骨形成提供充分的營養(yǎng)。此外，由于微孔變大，BMP逐漸被釋放，保證了骨缺損部位的充足BMP濃度，作用于間充質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，轉(zhuǎn)化成軟骨和成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨修復(fù)。

[1]王強(qiáng).CS/β-TCP/rhBMP-2復(fù)合因子加血管束修復(fù)兔下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D].山東大學(xué),2012.

[2]鄭軍.HA/TCP復(fù)合BMP及bFGF在體內(nèi)成骨能力及對骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究[D].東南大學(xué),2005.

TCP Composite BMP-2 induced Differentiation of hMSCs Development Coordination Mechanism Research

LI Kexin, XU Lan, LI Zhoubang, LIU Yeqin

(Jiamusi University in Heilongjiang Province, Heilongjiang Jianmusi 154007, China)

ObjectiveTo discuss the TCP composite BMP-2 induce the differentiation of hMSCs osteogenesis coordination mechanism. MethodsRespectively, the preparation of TCP stents and TCP compound BMP-2 material, since the separation of three volunteers to extend the hMSCs amplification, third-generation cell inoculation prepared scaffold materials, in a composite measure 1, 3, 7 days after the activity of ALP and compare. ResultsIn a composite after 1 day, ALP activity value comparison between the two groups have no significant difference (P>0.05); 3 and 7 days after composite ALP activity value is significant difference between the two groups (P<0.05); TCP and cell culture group of 1, 3, 7 days the ALP activity of value difference was not significant, no statistical significance (P>0.05); TCP composite BMP-2 with cell culture group of 1, 3, 7 days the ALP activity of value as the extension of incubation time, gradually increased. ConclusionBMP-2 can coordinate the TCP promote hMSCs differentiation effect, gene therapy may provide a new treatment approach for bone diseases.

TCP; BMP-2; human bone marrow mesenchymal stem cells; mechanism research

1006-446X(2016)07-0014-03

2015 - 11 - 04

R 681

A