Hedgehog信號轉(zhuǎn)導通路與軟骨細胞

肖良　徐宏光

241001　安徽蕪湖，　　皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院脊柱骨科

?

Hedgehog信號轉(zhuǎn)導通路與軟骨細胞

肖良徐宏光

241001安徽蕪湖，皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院脊柱骨科

摘要大量研究表明，Hedgehog(Hh)信號轉(zhuǎn)導通路的異常激活與多種骨關節(jié)軟骨慢性退行性疾病相關。Hh基因包括Sonic hedgehog(Shh)、 Indian hedgehog(Ihh)和Desert hedgehog(Dhh)。Ihh在軟骨內(nèi)成骨不同時期通過不同途徑調(diào)控軟骨細胞的分化發(fā)育，維持骨穩(wěn)定生長；Shh主要促進胚胎時期肢體和脊髓中的骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)向軟骨細胞分化；BMSC成軟骨分化是一個復雜的過程，各信號通路雖然可單獨起作用，但共同發(fā)揮調(diào)控作用更為重要。該文就Hh信號轉(zhuǎn)導通路分類及構(gòu)成、Hh信號轉(zhuǎn)導通路與軟骨細胞分化和發(fā)育、Hh信號轉(zhuǎn)導通路與軟骨退變等方面作一綜述。

關鍵詞Hedgehog信號轉(zhuǎn)導通路；軟骨細胞；調(diào)控機制

脊椎動物骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)成骨途徑包括膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨，其中軟骨內(nèi)成骨為主要成骨方式，其主要通過軟骨的形成與退化、骨組織逐漸替代軟骨組織等方式成骨。研究表明，Hedgehog(Hh)信號轉(zhuǎn)導通路為調(diào)控機體發(fā)育的重要信號通路[1]，除了參與成骨過程中軟骨形成和骨化外，還與多種骨關節(jié)疾病的發(fā)生發(fā)展關系密切。因此，揭示Hh信號轉(zhuǎn)導通路在軟骨發(fā)育與退變中的內(nèi)在機制對預防和治療骨疾病具有重大潛在價值。本文就Hh信號轉(zhuǎn)導通路與軟骨細胞研究進展作一綜述。

1Hh信號轉(zhuǎn)導通路分類及構(gòu)成

哺乳動物體內(nèi)Hh基因包括3種同源基因： Sonic hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh)和Desert hedgehog(Dhh)，其編碼的蛋白質(zhì)前體經(jīng)分子內(nèi)裂解、脂質(zhì)化等形成含有N末端和C末端的多聚體，其中N末端具有傳遞信號的功能[2]。Hh配體形成后可作用于相應細胞膜受體。Hh信號轉(zhuǎn)導通路在細胞膜上的受體為Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)，其中Ptc為12 次跨膜蛋白，對信號通路起負性調(diào)節(jié)作用；Smo為特殊的7 次跨膜蛋白，是信號通路激活所必需的受體之一。當無Hh配體存在時，Ptc 通過結(jié)合Smo來抑制其活性，轉(zhuǎn)錄激活因子Gli蛋白(包括Gli1、Gli2、Gli3，其中Gli1 和Gli2 起激活作用，Gli3 起抑制作用)與微管結(jié)合蛋白形成復合體并附著在微管上無法進入細胞核，Gli逐漸被蛋白激酶A(PKA)磷酸化，最終被蛋白酶分解[3]。分解產(chǎn)物GliR是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，可抑制細胞核中Hh靶基因的轉(zhuǎn)錄。當存在編碼的Hh配體時，Hh配體會與Ptc 受體結(jié)合，解除其對Smo的抑制。釋放的Smo 與Cos2、Fu 結(jié)合形成復合物，同時抑制PKA 活性，從而抑制Gli的分解，有利于完整的Gli進入細胞核，激活相應Hh靶基因[4-6]。

2Hh信號轉(zhuǎn)導通路與軟骨細胞分化和發(fā)育

2.1Ihh調(diào)控軟骨細胞分化

在BMSC增殖和成軟骨分化過程中，Ihh起著重要的調(diào)控作用[7-8]。軟骨細胞肥大化是軟骨內(nèi)骨化過程中的關鍵步驟。大量研究表明，Ihh通過甲狀旁腺激素相關蛋白(PTHrP)途徑來調(diào)節(jié)軟骨細胞分化。多數(shù)學者[9]認為，Ihh通過與PTHrP形成負反饋軸來影響軟骨分化，即由肥大前軟骨細胞分泌Ihh誘導PTHrP合成，PTHrP再作用于效應細胞膜受體甲狀旁腺激素(PTH)/PTHrP受體(PPR)，從而抑制局部區(qū)域內(nèi)軟骨細胞持續(xù)肥大，使其保持增殖狀態(tài)，同時通過PKA途徑負向調(diào)控Ihh表達，最終使BMSC向成軟骨細胞分化，抑制其肥大老化[9]。當PTHrP合成降低至一定水平時，軟骨細胞則會停止增生并肥大化[10]。Ihh缺乏時，PTHrP合成減少，進一步促進軟骨細胞肥大老化[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，除調(diào)節(jié)BMSC向成軟骨細胞分化外，Ihh還進一步參與了滑膜關節(jié)軟骨的形成及維持。但也有學者發(fā)現(xiàn)，在含PTHrP-/-個體的軟骨組織或軟骨細胞內(nèi)，當Ihh蛋白過表達時，仍可使軟骨細胞肥大，但當Hh特異性抑制劑環(huán)靶明存在或Smo被移除時，軟骨細胞肥大則發(fā)生延遲。以上現(xiàn)象提示，Ihh 可能不依賴PTHrP 途徑來促進軟骨細胞肥大，但其具體調(diào)控機制尚未闡明。Choi等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Ihh可通過調(diào)節(jié)Wnt信號轉(zhuǎn)導通路降解Nkx3.2蛋白，進而促進軟骨肥大，而Nkx3.2 蛋白能促進軟骨細胞早期分化和維持細胞存活，并且抑制軟骨細胞凋亡。綜上所述， Ihh在軟骨內(nèi)成骨不同時期通過不同途徑調(diào)控軟骨細胞的分化發(fā)育，維持骨穩(wěn)定生長。

2.2Shh調(diào)控軟骨細胞分化

Shh雖然與Ihh互為同源蛋白，但在調(diào)節(jié)軟骨細胞分化過程中發(fā)揮不同作用[14]。Shh主要促進胚胎時期肢體和脊髓中的BMSC向軟骨細胞分化。研究[15]發(fā)現(xiàn)，前體節(jié)中胚層Shh通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號轉(zhuǎn)導通路促使Nkx3.2和Sox9形成自調(diào)節(jié)回路，繼而調(diào)控軟骨細胞分化與增殖，且對分化晚期有特異性作用。Shh對軟骨細胞早期形成也有重要作用，可使軟骨細胞特異性胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖(AGC)合成增加[16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ通過上調(diào)Shh信號，激活轉(zhuǎn)錄因子Gli1入核，進而促進成軟骨分化及維持軟骨表型，當Shh信號被阻斷時，該作用明顯減弱。

2.3Hh信號轉(zhuǎn)導通路與其他信號轉(zhuǎn)導通路串話調(diào)控軟骨細胞分化

多項研究[18-20]表明，Hh信號轉(zhuǎn)導通路與其他信號轉(zhuǎn)導通路之間存在廣泛串話,如 Hh信號轉(zhuǎn)導通路在轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、BMP和Wnt/β-catenin等信號轉(zhuǎn)導通路上游調(diào)控BMSC成軟骨分化。早期軟骨細胞形成中，Ihh與Runx基因關系密切，上調(diào)的Gli1蛋白能激活Runx2和Runx3表達，協(xié)同促進BMSC向成軟骨細胞分化[21]。此外，多種軟骨細胞肥大和終末分化調(diào)節(jié)因子如維生素 D3、纖維母細胞生長因子受體-3等也通過與Ihh 相互影響發(fā)揮作用[22-23]。 Shh可誘導Nkx3.2來調(diào)控Runx的表達，從而維持軟骨細胞表型和胞外基質(zhì)分泌[24]。綜上所述，BMSC成軟骨分化是一個復雜的過程，各信號通路雖然可單獨起作用，但通過串話共同發(fā)揮調(diào)控作用更為重要。

3Hh信號轉(zhuǎn)導通路與軟骨退變

軟骨退變與多種慢性骨關節(jié)疾病密切相關，如骨關節(jié)炎(OA)、類風濕關節(jié)炎(RA)、椎間盤退變等[25-27]。軟骨退變的實質(zhì)為軟骨細胞的異常分化，與軟骨內(nèi)成骨過程中的軟骨細胞分化階段類似，均經(jīng)歷細胞肥大、終末分化、礦化，最終凋亡的過程。正常軟骨細胞主要分泌Ⅱ型膠原蛋白和AGC，當軟骨細胞發(fā)生退變時，則特異性分泌Ⅹ型膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13和蛋白聚糖酶促進軟骨鈣化[28]。胚胎發(fā)育成熟后, Hh信號轉(zhuǎn)導通路進入沉默狀態(tài)，當機體處于病理狀態(tài)(如缺血、組織損傷和力學載荷失衡等)時，則會被再次激活[29]。近年來有學者發(fā)現(xiàn)Hh信號轉(zhuǎn)導通路的異?；罨瘜浌峭俗儼l(fā)生發(fā)展具有重要作用。Wei等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在OA的軟骨和關節(jié)液中Ihh表達明顯增高，且增高程度與軟骨細胞肥大相關基因MMP-13 和Ⅹ型膠原蛋白表達程度呈正相關，用siRNA轉(zhuǎn)染和環(huán)靶明作用于軟骨細胞抑制Hh信號轉(zhuǎn)導通路，結(jié)果Ⅹ型膠原蛋白和MMP-13表達下調(diào)。因此，在人OA軟骨中，Ihh信號轉(zhuǎn)導通路的激活可促進軟骨細胞肥大并上調(diào)MMP-13表達，進而導致軟骨結(jié)構(gòu)的破壞。Runx2在成骨細胞分化和軟骨細胞成熟過程中必不可少。Amano等[31]研究發(fā)現(xiàn)，Hh信號轉(zhuǎn)導通路通過下游轉(zhuǎn)錄因子Gli結(jié)合Runx2來實現(xiàn)軟骨細胞中Ⅹ型膠原蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達，從而使軟骨出現(xiàn)鈣化。Wang 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，與急性椎體骨折患者相比，椎間盤退變患者的終板軟骨內(nèi)Hh信號轉(zhuǎn)導通路明顯激活，Ⅹ型膠原蛋白和MMP-13表達明顯增高，且表達量與軟骨退變程度呈正相關；為了進一步明確相關機制，利用siRNA轉(zhuǎn)染抑制Ihh表達，發(fā)現(xiàn)軟骨細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2、Gli3、Runx2、MMP-13、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅹ型膠原蛋白含量減少，Ⅱ型膠原蛋白明顯增加，而當質(zhì)粒重組過表達Ihh后，結(jié)果正好相反，因此認為Hh信號轉(zhuǎn)導通路在椎間盤退變的終板軟骨細胞內(nèi)通過減少Ⅱ型膠原蛋白和增加軟骨肥大鈣化標志物Ⅰ型膠原蛋白、Ⅹ型膠原蛋白的方式促進軟骨細胞退變。Ali等[33]研究發(fā)現(xiàn)，Hh信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控軟骨細胞內(nèi)膽固醇的動態(tài)平衡，Gli轉(zhuǎn)錄水平提高時，可引起軟骨細胞內(nèi)膽固醇異常聚集，進而加重OA。綜上所述，Hh信號轉(zhuǎn)導通路在慢性骨關節(jié)疾病軟骨病理形成過程中具有重要促進作用。

4展望

Hh信號轉(zhuǎn)導通路對于胚胎時期軟骨細胞的發(fā)育和胚胎成熟后軟骨細胞功能的調(diào)控都至關重要，先天性缺失或后天性異常激活都會促使機體產(chǎn)生各種疾患，但其具體調(diào)控機制目前仍不明確。外界刺激激活Hh信號轉(zhuǎn)導通路方式、Hh信號轉(zhuǎn)導通路被激活后使軟骨細胞發(fā)生病理改變機制也有待進一步解答。軟骨細胞自然形成和軟骨表型維持需要多種信號分子、信號通路協(xié)調(diào)運作，因此Hh信號轉(zhuǎn)導通路與其他信號轉(zhuǎn)導通路的串話機制亦將成為研究BMSC成軟骨分化領域的熱點。此外，軟骨細胞生長發(fā)育也離不開外周生長環(huán)境及生物力學因素影響。目前對于軟骨細胞的研究多將信號調(diào)控與外界環(huán)境刺激分開進行，今后的研究應注重BMSC和軟骨細胞生長的物理化學環(huán)境，建立細胞、器官以及在體動物等相關模型，為進一步探究軟骨細胞生長發(fā)育和退變機制提供新的思路和方法。

參考文獻

[ 1 ]Nusslein-Volhard C, Wieschaus E. Mutations affecting segment number and polarity in drosophila[J]. Nature, 1980, 287(5785):795-801.

[ 2 ]Gradilla AC, Guerrero I. Hedgehog on the move: a precise spatial control of hedgehog dispersion shapes the gradient[J]. Curr Opin Genet Dev, 2013, 23(4):363-373.

[ 3 ]Liem KF Jr, He M, Ocbina PJ, et al. Mouse Kif7/Costal2 is a cilia-associated protein that regulates sonic hedgehog signaling[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(32):13377-13382.

[ 4 ]Humke EW, Dorn KV, Milenkovic L, et al. The output of hedgehog signaling is controlled by the dynamic association between suppressor of fused and the gli proteins[J]. Genes Dev, 2010, 24(7):670-682.

[ 5 ]Tukachinsky H, Lopez LV, Salic A. A mechanism for vertebrate hedgehog signaling: recruitment to cilia and dissociation of SuFu-Gli protein complexes[J]. J Cell Biol, 2010, 191(2):415-428.

[ 6 ]Li ZJ, Nieuwenhuis E, Nien W, et al. Kif7 regulates Gli2 through Sufu-dependent and independent functions during skin development and tumorigenesis[J]. Development, 2012, 139(22):4152-4161.

[ 7 ]Wu X, Li SH, Lou LM, et al. The effect of the microgravity rotating culture system on the chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Mol Biotechnol, 2013, 54(2):331-336.

[ 8 ]Worthley DL, Churchill M, Compton JT, et al. Gremlin 1 identifies a skeletal stem cell with bone, cartilage, and reticular stromal potential[J]. Cell, 2015, 160(1-2):269-284.

[ 9 ]Fischer J, Dickhut A, Rickert M, et al. Human articular chondrocytes secrete parathyroid hormone-related protein and inhibit hypertrophy of mesenchymal stem cells in coculture during chondrogenesis[J]. Arthritis Rheum, 2010, 62(9):2696-2706.

[10]Zhao Q, Brauer PR, Xiao L, et al. Expression of parathyroid hormone-related peptide (PthrP) and its receptor (PTH1R) during the histogenesis of cartilage and bone in the chicken mandibular process[J]. J Anat, 2002, 201(2):137-151.

[11]Vortkamp A, Lee K, Lanske B, et al. Regulation of rate of cartilage differentiation by Indian hedgehog and PTH-related protein[J]. Science, 1996, 273(5275):613-622.

[12]Fischer J, Aulmann A, Dexheimer V, et al. Intermittent PTHrP(1-34) exposure augments chondrogenesis and reduces hypertrophy of mesenchymal stromal cells[J]. Stem Cells Dev, 2014, 23(20):2513-2523.

[13]Choi SW, Jeong DU, Kim JA, et al. Indian hedgehog signalling triggers Nkx3.2 protein degradation during chondrocyte maturation[J]. Biochem J, 2012, 443(3):789-798.

[14]張雪萍,馬曉麗,汪運山，等. 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中Hedgehog信號分子的表達[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2011, 15(14):2487-2490.

[15]Zeng L, Kempf H, Murtaugh LC, et al. Shh establishes an Nkx3.2/Sox9 autoregulatory loop that is maintained by BMP signals to induce somitic chondrogenesis[J]. Genes Dev, 2002, 16(15):1990-2005.

[16]Warzecha J, Gottig S, Bruning C, et al. Sonic hedgehog protein promotes proliferation and chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro[J]. J Orthop Sci, 2006, 11(5):491-496.

[17]Li X, Wei G, Wang X, et al. Targeting of the sonic hedgehog pathway by atractylenolides promotes chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells[J]. Biol Pharm Bull, 2012, 35(8):1328-1335.

[18]Iwakura T, Inui A, Reddi AH. Stimulation of superficial zone protein accumulation by hedgehog and Wnt signaling in surface zone bovine articular chondrocytes[J]. Arthritis Rheum, 2013, 65(2):408-417.

[19]Hojo H, Ohba S, Taniguchi K, et al. Hedgehog-Gli activators direct osteo-chondrogenic function of bone morphogenetic protein toward osteogenesis in the perichondrium[J]. J Biol Chem, 2013, 288(14):9924-9932.

[20]Keller B, Yang T, Chen Y, et al. Interaction of TGFβ and BMP signaling pathways during chondrogenesis[J]. PLoS One, 2011, 6(1):e16421.

[21]Kim EJ, Cho SW, Shin JO, et al. Ihh and Runx2/Runx3 signaling interact to coordinate early chondrogenesis: a mouse model[J]. PLoS One, 2013, 8(2):e55296.

[22]Klotz B, Mentrup B, Regensburger M, et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 treatment delays cellular aging in human mesenchymal stem cells while maintaining their multipotent capacity[J]. PLoS One, 2012, 7(1):e29959.

[23]Grande DA, Mason J, Light E, et al. Stem cells as platforms for delivery of genes to enhance cartilage repair[J]. J Bone Joint Surg Am, 2003, 85(Suppl 2):111-116.

[24]Kawato Y, Hirao M, Ebina K, et al. Nkx3.2-induced suppression of Runx2 is a crucial mediator of hypoxia-dependent maintenance of chondrocyte phenotypes[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 416(1-2):205-210.

[25]Zhou J, Wei X, Wei L. Indian hedgehog, a critical modulator in osteoarthritis, could be a potential therapeutic target for attenuating cartilage degeneration disease[J]. Connect Tissue Res, 2014, 55(4):257-261.

[26]Zhou J, Chen Q, Lanske B, et al. Disrupting the Indian hedgehog signaling pathway in vivo attenuates surgically induced osteoarthritis progression in Col2a1-CreERT2; Ihhfl/fl mice[J]. Arthritis Res Ther, 2014, 16(1):R11.

[27]Razzak M. Osteoarthritis: the hedgehog and the bony spur[J]. Nat Rev Rheumatol, 2012, 8(3):123.

[28]van der Kraan PM, van den Berg WB. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration?[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2012, 20(3):223-232.

[29]van Hook AM. Focus issue: fine-tuning Hedgehog signaling in development and disease[J]. Sci Signal, 2011, 4(200):eg10.

[30]Wei F, Zhou J, Wei X, et al. Activation of Indian hedgehog promotes chondrocyte hypertrophy and upregulation of MMP-13 in human osteoarthritic cartilage[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2012, 20(7):755-763.

[31]Amano K, Densmore M, Nishimura R, et al. Indian hedgehog signaling regulates transcription and expression of collagen type Ⅹ via Runx2/Smads interactions[J]. J Biol Chem, 2014, 289(36):24898-24910.

[32]Wang S, Yang K, Chen S, et al. Indian hedgehog contributes to human cartilage endplate degeneration[J]. Eur Spine J, 2015, 24(8):1720-1728.

[33]Ali SA, Al-Jazrawe M, Ma H, et al. Regulation of cholesterol homeostasis by hedgehog signaling in osteoarthritic cartilage[J]. Arthritis Rheumatol, 2016, 68(1):127-137.

(收稿：2015-09-22；修回：2015-11-21)

(本文編輯：李圓圓)

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.02.008

通信作者：徐宏光E-mail: xuhg@medmail.com.cn

基金項目：國家自然科學基金(81272048)