表皮葡萄球菌引起假體周圍感染的生物膜形成機(jī)制

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200233，　　上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科

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表皮葡萄球菌引起假體周圍感染的生物膜形成機(jī)制

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200233，上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科

摘要關(guān)節(jié)假體周圍感染是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，表皮葡萄球菌是導(dǎo)致假體周圍感染的最主要致病菌之一。感染過(guò)程中，細(xì)菌通過(guò)在植入物表面定植形成生物膜，從而有效逃避抗生素和宿主免疫反應(yīng)，并通過(guò)群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)生物膜的成長(zhǎng)過(guò)程。該文就表皮葡萄球菌引起假體周圍感染的生物膜形成機(jī)制作一綜述。

關(guān)鍵詞表皮葡萄球菌；假體周圍感染；生物膜；群體感應(yīng)系統(tǒng)

假體周圍感染的發(fā)病率不高，一般僅為1%～2%[1]，然而一旦發(fā)病，不僅可增加患者致殘率和致死率，還會(huì)延長(zhǎng)住院時(shí)間、增加住院費(fèi)用，給患者和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，積極探究假體周圍感染的發(fā)病機(jī)制，尤其是致病菌生物膜形成機(jī)制，對(duì)提高人工關(guān)節(jié)置換術(shù)的成功率和治療效果意義重大[2]。

1假體周圍感染特點(diǎn)

假體周圍感染的顯著特點(diǎn)之一是在假體存在時(shí)很低數(shù)量的細(xì)菌即可導(dǎo)致感染形成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在出現(xiàn)異物的情況下，形成感染所需的細(xì)菌濃度可以降低105倍。大量研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)假體是異物，而這與細(xì)菌在假體表面形成生物膜有關(guān)。細(xì)菌通過(guò)直接感染假體表面、感染鄰近組織及血源性播散感染等途徑導(dǎo)致假體周圍感染[5]。

引起假體周圍感染的病原體在不同國(guó)家和地區(qū)有所不同，在美國(guó)最常見(jiàn)的病原體是金黃色葡萄球菌，其次是表皮葡萄球菌，而在歐洲和中國(guó)引起假體周圍感染的主要病原體是凝固酶陰性葡萄球菌，其次是金黃色葡萄球菌[2,6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染病例中47%為凝固酶陰性葡萄球菌感染，19%為金黃色葡萄球菌感染，而凝固酶陰性葡萄球菌感染中表皮葡萄球菌感染最為常見(jiàn)[7]。

2表皮葡萄球菌及其分子流行病學(xué)

正常情況下，表皮葡萄球菌是定植在皮膚和黏膜上的共生菌，為人體含量最多的葡萄球菌。流行病學(xué)研究[8]顯示，正常人攜帶的表皮葡萄球菌菌株數(shù)量為10～24株。表皮葡萄球菌成為最常見(jiàn)的假體周圍感染致病菌的原因?yàn)椋孩俦砥て咸亚蚓鷱V泛定植在所有人群的黏膜上皮；②表皮葡萄球菌可以形成生物膜并定植在生物材料表面，形成抗生素耐藥和免疫逃逸[9]；③表皮葡萄球菌群體可以形成有機(jī)整體，通過(guò)群體感應(yīng)功能調(diào)節(jié)進(jìn)一步適應(yīng)周圍環(huán)境變化[10]。這些因素增加了假體表面表皮葡萄球菌感染的預(yù)防和治療難度。

由于不同細(xì)菌亞型克隆的黏附材料表面、形成生物膜、免疫逃逸、對(duì)抗治療的毒力因子和調(diào)節(jié)毒力因子等方式有所不同[11]，因此進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，在分子或基因水平闡明細(xì)菌種類和分型，進(jìn)而研究感染機(jī)制，對(duì)感染控制和治療有深遠(yuǎn)意義[12]。有學(xué)者[13]對(duì)表皮葡萄球菌進(jìn)行基于測(cè)序分析的多位點(diǎn)序列分型(MLST)研究，發(fā)現(xiàn)最常見(jiàn)的假體周圍感染臨床分離株是ST2和ST215，這可能與這些細(xì)菌高度多重耐藥性和生物膜形成有關(guān)。雖然表皮葡萄球菌的核心基因序列與金黃色葡萄球菌相似，但缺乏毒力因子和致病島。比較研究發(fā)現(xiàn)，參與表皮葡萄球菌引起假體周圍感染生物膜形成的核心基因有ica、app、altE、sdrG、agr、luxS等。

3生物膜組成與作用

生物膜是依附于假體表面并由胞外多聚物和基質(zhì)網(wǎng)包被的高度組織化和系統(tǒng)化的復(fù)雜微生物群落。群落可能由單種細(xì)菌組成，也可能由多種細(xì)菌組成，但即使是由單種細(xì)菌組成，其不同亞型細(xì)菌的基因型和表現(xiàn)也各不相同。在生物膜內(nèi)，這些微生物逐漸形成結(jié)構(gòu)功能不同的復(fù)雜群落，具有許多類似高等生物組織的功能[14]。生物膜細(xì)胞外基質(zhì)成分較復(fù)雜，主要由多糖、蛋白質(zhì)、磷壁酸和細(xì)胞外DNA組成，其組成部分在不同個(gè)體，甚至同一個(gè)體不同生物膜之間的差異很大。在生物膜保護(hù)下，膜內(nèi)細(xì)菌可有效逃避抗生素的殺菌作用和宿主免疫反應(yīng)，較浮游細(xì)菌擁有多達(dá)1 000倍的抵抗能力[15]。這種內(nèi)在保護(hù)機(jī)制是多樣的，即使在同種抗生素和宿主內(nèi)，其機(jī)制也會(huì)有所不同。首先，生物膜構(gòu)成一道機(jī)械屏障，使免疫細(xì)胞很難進(jìn)入膜內(nèi)，并抑制吞噬細(xì)胞的吞噬作用。生物膜可以限制某些抗生素的擴(kuò)散，如金黃色葡萄球菌限制環(huán)丙沙星在生物膜中的擴(kuò)散，但也可以促進(jìn)部分抗生素在生物膜中的擴(kuò)散，如利福平、萬(wàn)古霉素和達(dá)托霉素等可在表皮葡萄球菌生物膜中擴(kuò)散[16]，因此可以嘗試?yán)眠@些藥物治療感染。其次，生物膜內(nèi)的細(xì)菌處于休眠狀態(tài)，在這種狀態(tài)下細(xì)菌細(xì)胞分裂、蛋白合成、核酸復(fù)制等代謝活動(dòng)減弱。這種特點(diǎn)使許多通過(guò)干擾細(xì)菌上述代謝活動(dòng)的藥物作用減弱[17]。最后，生物膜過(guò)表達(dá)的蛋白或生物多聚體可能在耐藥性方面起到重要作用。

4生物膜形成機(jī)制

生物膜生長(zhǎng)過(guò)程是一動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，可分為黏附、聚集、成熟和脫落4個(gè)階段。生物膜的形成始于細(xì)菌在黏附分子、表面張力及靜電作用下的表面黏附，然后細(xì)胞聚集并合成胞外多糖，經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)分化發(fā)展為成熟的生物膜，最后生物膜在周圍環(huán)境影響下發(fā)生脫落，釋放浮游細(xì)菌，形成新的感染灶[10,18]。

4.1黏附

細(xì)菌可以直接黏附到生物體或非生物體表面，其黏附到非生物體如假體或移植的醫(yī)療器械表面依賴于內(nèi)植物和細(xì)菌的物理生化性質(zhì)，主要通過(guò)疏水性和靜電作用介導(dǎo)[10]。此外，一些特殊的蛋白如自溶素E和表皮葡萄球菌自溶素Aae也參與細(xì)菌直接黏附到非生物體表面的過(guò)程。自溶素E和Aae特異性較低，可與纖維蛋白原、纖連蛋白和玻連蛋白非特異性結(jié)合[19]，還可促使細(xì)菌釋放細(xì)胞外DNA，在表皮葡萄球菌生物膜形成中起到重要作用[20]。當(dāng)假體植入體內(nèi)時(shí)，血清蛋白(包括纖維蛋白原、纖連蛋白、膠原蛋白和玻連蛋白等)快速覆蓋到假體表面，表皮葡萄球菌通過(guò)表面蛋白與血清蛋白相互作用間接黏附于假體表面。表皮葡萄球菌有許多表面蛋白，這些表面蛋白被稱為細(xì)菌表面識(shí)別黏附基質(zhì)分子(MSCRAMMS)，MSCRAMMS可與血清蛋白和組織蛋白相互作用。目前研究最廣泛的MSCRAMM是Sdr家族蛋白。Sdr家族蛋白是一類細(xì)菌表面蛋白，屬于含有絲氨酸-天冬氨酸重復(fù)序列的基因編碼蛋白。這個(gè)家族包括3個(gè)成員，即SdrF、SdrG、SdrH。表皮葡萄球菌可通過(guò)SdrG和SdrF分別與纖維蛋白原和膠原蛋白共價(jià)結(jié)合。體外實(shí)驗(yàn)顯示，SdrG是表皮葡萄球菌黏附到纖維蛋白原的必要條件。在體內(nèi)SdrG表達(dá)增加時(shí)，抗SdrG抗體即會(huì)出現(xiàn)，sdrG基因敲除可導(dǎo)致表皮葡萄球菌黏附纖維蛋白原表面的能力下降，因此SdrG感染對(duì)于表皮葡萄球菌感染過(guò)程非常重要[20-21]。研究[22]表明，SdrG具有促進(jìn)血小板黏附和聚集的作用。

此外，胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白(Embp)是一類能與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合的大蛋白，它的相對(duì)分子質(zhì)量為1 100 000，具有細(xì)胞間黏附的特性。研究[23]發(fā)現(xiàn)，Embp亞型(相對(duì)分子質(zhì)量460 000)可結(jié)合纖連蛋白，不但可以在icaADBC陰性和聚集相關(guān)蛋白(Aap)陰性的細(xì)菌亞型中調(diào)節(jié)生物膜的黏附和聚集，而且可以抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬作用，促使細(xì)菌生物膜形成。

4.2聚集

已黏附的細(xì)菌通過(guò)分裂增殖使生物膜增厚，并合成多種胞外多聚物如多糖胞間黏附素(PIA)、Aap和磷壁酸等將細(xì)菌包裹在內(nèi)，同時(shí)形成通道與空隙供細(xì)菌進(jìn)行物質(zhì)代謝與信息交流。PIA又稱為多聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG)，與表皮葡萄球菌致病性密切相關(guān)，不僅參與生物膜形成、介導(dǎo)免疫逃逸、提高表皮葡萄球菌耐藥性，還影響生物膜三維結(jié)構(gòu)。PIA由ica操縱子編碼的酶蛋白催化合成，ica基因座包含icaA(1 238 bp)、icaD(305 bp)、icaB(869 bp)和icaC(1 067 bp)4個(gè)功能基因[24]，以及在ica基因座上游具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用的icaR基因(557 bp)。IcaA與IcaD結(jié)合，可使活化的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)單體產(chǎn)生1條鏈，該鏈的延長(zhǎng)依賴于IcaC，并在IcaB作用下脫去乙?；?，最終合成PNAG[24]。ica操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有很多，包括SarA、SarZ、LuxS、ClpP等。

盡管在多數(shù)細(xì)菌中PIA對(duì)生物膜的形成是必需的，然而仍有部分細(xì)菌在沒(méi)有ica基因編碼PIA的情況下也能形成生物膜，這類細(xì)菌的PIA由其他蛋白如Aap、生物膜相關(guān)蛋白(Bap/Bhp)和Embp等替代，可能與纖連蛋白形成有關(guān)[22,25]。Aap是一種相對(duì)分子質(zhì)量為20 000的LPXTG蛋白序列，包括N-端A區(qū)域和B區(qū)域128個(gè)可變重復(fù)序列。它的聚集作用是通過(guò)細(xì)菌和宿主的蛋白酶活化來(lái)實(shí)現(xiàn)。它的聚集由鄰近細(xì)胞B區(qū)域Zn2+依賴的二聚體激活，A區(qū)域則介導(dǎo)黏附到角質(zhì)細(xì)胞，這可能與表皮葡萄球菌黏附到皮膚有一定關(guān)系[25]。磷壁酸是革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞表面的特征性組成部分，它們可能通過(guò)經(jīng)典作用與其他表面多聚物相互作用，形成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。作為一類多聚陰離子分子，磷壁酸具有保持陽(yáng)離子平衡、為細(xì)胞壁蛋白提供錨定基礎(chǔ)、調(diào)節(jié)自溶酶活性等作用[26]。在磷壁酸存在的情況下，胞外DNA所帶的負(fù)電荷在與其他表面結(jié)構(gòu)相互作用過(guò)程中起到重要作用[27]。

4.3成熟

生物膜內(nèi)的細(xì)菌轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)下的細(xì)菌完全不同。實(shí)驗(yàn)表明，生物膜內(nèi)葡萄球菌的代謝方式主要轉(zhuǎn)向無(wú)氧代謝和微需氧代謝，且下調(diào)蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁和DNA合成。生物膜內(nèi)的細(xì)菌對(duì)其周圍環(huán)境具有時(shí)間和空間反應(yīng)。Rani等[28]研究發(fā)現(xiàn)，生物膜內(nèi)的表皮葡萄球菌至少有4種生長(zhǎng)狀態(tài)，即有氧生長(zhǎng)、無(wú)氧生長(zhǎng)、休眠細(xì)胞和死亡細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，破壞特定時(shí)期的生物膜可能增加細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性。在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜中，精氨酸脫亞胺酶(adI)操縱子表達(dá)常發(fā)生上調(diào)[16]，其介導(dǎo)的精氨酸代謝在細(xì)菌代謝狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬跎L(zhǎng)過(guò)程中起到重要作用。

多個(gè)研究表明，部分不產(chǎn)生PIA/生物膜的菌落發(fā)生表型變異。產(chǎn)生PIA的菌落呈粗糙的不規(guī)則狀，而不產(chǎn)生PIA的菌落呈光滑的奶油狀。表型變異是生物膜成熟的結(jié)果。Ziebuhr等[29]研究發(fā)現(xiàn)，30%的表型變異由IS-256插入ica操縱子引起。Handke等將非IS-256導(dǎo)致的表型轉(zhuǎn)換分為3類：Ⅰ型表型變異為icaADBC的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)導(dǎo)致幾乎無(wú)PIA合成；Ⅱ型表型變異為icaADBC轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯變化，但不產(chǎn)生任何PIA/生物膜；Ⅲ型表型變異為染色體大片區(qū)域缺失。然而，部分Ⅰ型和Ⅱ型表型變異的菌株在胰酪胨大豆培養(yǎng)基中充分培養(yǎng)可重新表達(dá)生成野生型菌株生物膜的能力。有研究[30]對(duì)表皮葡萄球菌SE5的3種變異類型進(jìn)行DNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)SE5 PV2(Ⅰ型表型變異)為rsbU突變，SE5 PV3和SE5 PV10(均為Ⅱ型表型變異)分別為icaA和icaD突變，這些不同的變異亞型拓寬了微生物群落的生存條件范圍。

4.4脫落

在葡萄球菌生物膜成熟過(guò)程中，一些細(xì)菌或細(xì)菌團(tuán)從生物膜上脫落，并隨著血流等轉(zhuǎn)移到其他器官，進(jìn)而形成急性非生物膜性感染如菌血癥等。目前研究表明，表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌脫落和擴(kuò)散過(guò)程依賴于agr基因，主要由agrB、agrD、agrC、和agrA基因簇形成。在兔模型中，agr突變的表皮葡萄球菌生物膜更厚，定植的細(xì)菌更多[30]。agr突變的表皮葡萄球菌生物膜增厚可能與酚溶解調(diào)控蛋白(PSM)有關(guān)[31-32]。PSM包括δ-毒素、PSMα和PSMβ，這些分子可作為表面活性劑，在生物膜表面抑制細(xì)菌的非共價(jià)結(jié)合。PSMβ可能可促進(jìn)生物膜相關(guān)感染的播散。此外，抗PSMβ抗體可阻礙生物膜表皮葡萄球菌播散[32]。

5表皮葡萄球菌群體感應(yīng)效應(yīng)對(duì)生物膜的調(diào)控

細(xì)菌表面分子的群體感應(yīng)依賴現(xiàn)象在許多細(xì)菌生物膜形成和脫落過(guò)程中普遍存在。群體感應(yīng)系統(tǒng)以細(xì)胞密度依賴的形式控制基因表達(dá)。目前輔助基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)agr和luxS QS系統(tǒng)是最主要的兩個(gè)感應(yīng)系統(tǒng)。表皮葡萄球菌的agr群體感應(yīng)系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)生物膜形成，該系統(tǒng)包括自誘導(dǎo)蛋白(AIP)、轉(zhuǎn)出酶(AgrB)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(AgrC、AgrA)[33]。agr群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控靶基因由DNA結(jié)合蛋白AgrC或RNA Ⅲ直接調(diào)控。AIP是長(zhǎng)度為7～9個(gè)氨基酸的多肽，含有保守的絲氨酸殘基，AIP可結(jié)合AgrC并促進(jìn)AgrC的自身磷酸化，反過(guò)來(lái)引起AgrA磷酸化和活化。AgrA活化P2啟動(dòng)子，控制agrB、agrD、agrC和agrA的表達(dá)，最終關(guān)閉群體感應(yīng)循環(huán)。同時(shí)，ArgA活化P3啟動(dòng)子能促進(jìn)RNA Ⅲ和δ-毒素的表達(dá)[24,33]。一般來(lái)說(shuō)，除非兩個(gè)種群非常相近(Ⅰ型和Ⅳ型金黃色葡萄球菌)，大多數(shù)自身種群的AIP激活agr反應(yīng)，而不同種群的AIP抑制agr反應(yīng)。Ⅰ型表皮葡萄球菌的AIP可抑制除少見(jiàn)的Ⅳ型金黃色葡萄球菌之外所有類型金黃色葡萄球菌的agr反應(yīng)，然而只有Ⅳ型金黃色葡萄球菌的AIP可以抑制Ⅰ型表皮葡萄球菌的agr反應(yīng)。因此，在群體感應(yīng)系統(tǒng)的相互抑制過(guò)程中，表皮葡萄球菌可能占有優(yōu)勢(shì)，但尚無(wú)證據(jù)證明其在表皮葡萄球菌體內(nèi)增殖的過(guò)程中起作用[34]。

生物膜外層的agr表達(dá)可促進(jìn)生物膜的脫落和再生長(zhǎng)，而agr基因同時(shí)也在生物膜表面表達(dá)，這對(duì)于生物膜隧道的形成非常重要。雖然agr群體感應(yīng)系統(tǒng)是生物膜成熟過(guò)程的主要調(diào)控因素，但不能調(diào)控PIA合成[10]。luxS QS系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌中，其催化合成的自體誘導(dǎo)分子2(AI-2)能實(shí)現(xiàn)種內(nèi)和種間交流。研究[35]發(fā)現(xiàn)，luxS QS系統(tǒng)在表皮葡萄球菌生物膜形成中起負(fù)調(diào)控作用，調(diào)控機(jī)制與ica操縱子依賴性通路有關(guān)，其突變能抑制ica的轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)改變PIA合成來(lái)調(diào)控生物膜形成。

6展望

隨著人工關(guān)節(jié)置換術(shù)應(yīng)用的增多，表皮葡萄球菌引起假體周圍感染機(jī)制被廣泛研究。探討表皮葡萄球菌生物膜形成機(jī)制及其相關(guān)調(diào)節(jié)因子對(duì)于預(yù)防和治療假體周圍感染具有非凡意義。但目前對(duì)表皮葡萄球菌生物膜的認(rèn)識(shí)十分有限，尤其對(duì)各基因調(diào)控和功能尚缺乏科學(xué)有效的體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)，需要建立更好的動(dòng)物感染模型，在分子基因水平上進(jìn)一步研究表皮葡萄球菌的致病機(jī)制。

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(收稿：2015-09-09; 修回：2015-12-17)

(本文編輯：盧千語(yǔ))

第二屆國(guó)際骨科講師團(tuán)教育峰會(huì)——霍普金斯專場(chǎng)通知

第二屆國(guó)際骨科講師團(tuán)教育峰會(huì)(OES)——霍普金斯專場(chǎng)將于2016年4月15-17日在西安舉行，由美國(guó)霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院、第四軍醫(yī)大學(xué)國(guó)際骨科教育學(xué)院與《中華創(chuàng)傷骨科雜志》聯(lián)合舉辦。峰會(huì)的課程設(shè)置、模式與操作均由美國(guó)霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院骨科全程實(shí)施，突出教育的國(guó)際化、標(biāo)準(zhǔn)化特點(diǎn)。本屆峰會(huì)著力打造四大亮點(diǎn)：①霍普金斯大學(xué)講師全程授課，著力面向中青年醫(yī)生講授骨科基本、原則、關(guān)鍵點(diǎn)和難點(diǎn)；②疑難病例會(huì)診、影像學(xué)資料解析，中美雙方專家將分別提供(參會(huì)醫(yī)生亦可提供)創(chuàng)傷、脊柱、關(guān)節(jié)等領(lǐng)域的疑難病例(成功或失敗)及影像學(xué)資料(X線、CT、MRI、PET等)分3個(gè)專會(huì)場(chǎng)進(jìn)行辨析、會(huì)診、互動(dòng)、權(quán)威點(diǎn)評(píng)；③workshop模擬手術(shù)操作，峰會(huì)將設(shè)置創(chuàng)傷、脊柱、關(guān)節(jié)(肩、肘、髖、膝、踝),3個(gè)專題會(huì)場(chǎng)，進(jìn)行為期半天的workshop模擬手術(shù)操作示教；④手術(shù)演示實(shí)況轉(zhuǎn)播，選擇脊柱、創(chuàng)傷2個(gè)經(jīng)典病例，由美方專家主刀手術(shù)，分2個(gè)會(huì)場(chǎng)實(shí)況同步直播，親臨感受國(guó)際骨科大師的頂級(jí)手術(shù)技藝。所有課程均設(shè)同聲傳譯，語(yǔ)言障礙自然無(wú)憂。

2016年初春古城西安，一場(chǎng)由國(guó)際頂尖學(xué)府美國(guó)霍普金斯大學(xué)全力打造、在中國(guó)傾力推出、中美雙方共創(chuàng)的"國(guó)際骨科講師團(tuán)教育峰會(huì)"之饕餮大餐將隆重開(kāi)幕，我們?cè)概c您共同分享！期待您的積極參與！如欲參加峰會(huì)，請(qǐng)及早報(bào)名，以便安排課位和準(zhǔn)備同傳耳機(jī)。聯(lián)系人：陳旭029-89535284/13110437257。

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.02.07

通信作者：張先龍E-mail: 2324173807@qq.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81472108)