第三代自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)研究進(jìn)展

林威　陳潔琳　朱偉民　王大平

510182，　　廣州醫(yī)科大學(xué)深圳市第二人民醫(yī)院臨床學(xué)院(林威)；518035，　　深圳市運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)技術(shù)工程研究中心(林威、陳潔琳、朱偉民、王大平)；518035，　　深圳市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(林威、陳潔琳、朱偉民、王大平)

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第三代自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)研究進(jìn)展

林威陳潔琳朱偉民王大平

510182，廣州醫(yī)科大學(xué)深圳市第二人民醫(yī)院臨床學(xué)院(林威)；518035，深圳市運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)技術(shù)工程研究中心(林威、陳潔琳、朱偉民、王大平)；518035，深圳市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(林威、陳潔琳、朱偉民、王大平)

摘要關(guān)節(jié)軟骨損傷后自我修復(fù)能力十分有限。傳統(tǒng)治療如微骨折術(shù)等效果往往不理想。自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)是目前修復(fù)軟骨缺損效果最佳的治療手段，其中第三代自體軟骨細(xì)胞移植顯示出較前兩代技術(shù)更佳的療效和前景。隨著組織工程技術(shù)及材料學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等發(fā)展，第三代自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)出現(xiàn)改良方案，其各具特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)。該文就第三代自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)研究進(jìn)展作一綜述。

關(guān)鍵詞軟骨損傷；自體軟骨細(xì)胞移植；組織工程；支架

關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管、神經(jīng)和淋巴組織，一旦損傷便難以修復(fù)，其生物力學(xué)也隨之改變[1]。傳統(tǒng)的治療手段包括關(guān)節(jié)灌洗、骨髓刺激術(shù)、軟骨移植術(shù)和人工關(guān)節(jié)置換術(shù)等。其中骨髓刺激術(shù)最為常用，其通過(guò)鉆孔、微骨折等方式引導(dǎo)骨髓腔內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞至缺損表面達(dá)到修復(fù)再生的目的，然而臨床研究證實(shí)這種再生軟骨為纖維軟骨，其生物力學(xué)性能和黏彈性較透明軟骨差[2]。軟骨移植術(shù)后再生軟骨多為透明軟骨，但供區(qū)軟骨來(lái)源有限、操作困難等限制其廣泛應(yīng)用[3]。Brittberg等[4]為尋求更理想的透明軟骨修復(fù)效果，于1994年首次嘗試應(yīng)用細(xì)胞技術(shù)修復(fù)軟骨，取非負(fù)重區(qū)軟骨分離出的軟骨細(xì)胞并將其體外擴(kuò)增培養(yǎng)，然后將細(xì)胞懸液注射至缺損處以自體骨膜覆蓋并嚴(yán)密縫合，此為第一代自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)(P-ACI)。然而，P-ACI因骨膜增生、供區(qū)受損等而應(yīng)用受限，以膠原膜替代骨膜的第二代自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)(C-ACI)應(yīng)運(yùn)而生[5]。多數(shù)研究表明，C-ACI療效較微骨折術(shù)、軟骨移植術(shù)好，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)其再生軟骨多為透明軟骨，但C-ACI易出現(xiàn)細(xì)胞漏滲、骨膜增生、細(xì)胞去分化等[6]。為解決上述缺陷，出現(xiàn)了第三代自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)，即以基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)(MACI)[7]。MACI首次將軟骨細(xì)胞種植于過(guò)渡性支架上，然后將復(fù)合細(xì)胞的支架植入缺損處，避免了細(xì)胞漏滲，同時(shí)支架為細(xì)胞提供了臨時(shí)三維生長(zhǎng)空間，有利于軟骨細(xì)胞表型維持和生長(zhǎng)[8]。隨后出現(xiàn)了許多改良技術(shù)，如 Hyalograft C、Bioseed C、NeoCart等，此類技術(shù)修復(fù)效果顯著，并已獲批準(zhǔn)運(yùn)用于臨床。

1經(jīng)典MACI

Behrens等[9]首次提出MACI，該技術(shù)將體外擴(kuò)增的自體軟骨細(xì)胞種植于豬來(lái)源的Ⅰ/Ⅲ型雙層膠原膜，移植時(shí)將粗糙面貼近缺損面，然后以生物蛋白膠結(jié)合縫合方式進(jìn)行固定。Basad等[10]報(bào)道65例MACI關(guān)節(jié)鏡患者中期隨訪結(jié)果，結(jié)果顯示早期Tegner評(píng)分、Lysholm評(píng)分顯著提高并持續(xù)至術(shù)后第5年，MRI檢查提示缺損填充良好。Aldrian等[11]在長(zhǎng)期隨訪中發(fā)現(xiàn)，MACI治療有癥狀的中重度關(guān)節(jié)軟骨缺損安全有效，術(shù)后5年內(nèi)患者疼痛、功能及活動(dòng)水平等均有明顯改善，影像學(xué)檢查提示患者術(shù)后組織修復(fù)好，與附著物結(jié)合緊密。對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，MACI較經(jīng)典微骨折術(shù)更具優(yōu)勢(shì)。Saris等[12]對(duì)144例有明顯臨床癥狀的軟骨缺損患者(缺損面積≥3 cm2)進(jìn)行隨機(jī)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，MACI患者術(shù)后改善顯著。Basad等[10]進(jìn)行40例MACI與20例微骨折術(shù)后2年隨訪對(duì)比研究，結(jié)果MACI患者Lysholm評(píng)分、Tegner評(píng)分、國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)(ICRS)評(píng)分明顯優(yōu)于微骨折術(shù)患者。然而，MACI尚未表現(xiàn)出較P-ACI和C-ACI明顯的優(yōu)勢(shì)。Benthien等[13]在一項(xiàng)大樣本調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，MACI與P-ACI、C-ACI療效相近，但MACI在技術(shù)上更具優(yōu)勢(shì)。其他類似研究[14]也表明MACI與P-ACI、C-ACI療效無(wú)明顯差異。

2 改良MACI

2.1Hyalograft C技術(shù)

Hyalograft C技術(shù)以透明質(zhì)酸芐基酯凝膠為支架，可在關(guān)節(jié)鏡下完成手術(shù)，目前其應(yīng)用廣泛程度僅次于經(jīng)典MACI。透明質(zhì)酸屬于天然聚陰離子黏多糖，具有獨(dú)特的流變性能和良好的生物相容性，存在于人體所有的疏松結(jié)締組織中[15]。透明質(zhì)酸在葡萄糖醛酸與芐基乙醇作用下酯化生成透明質(zhì)酸芐基酯凝膠，透明質(zhì)酸芐基酯凝膠較透明質(zhì)酸支撐強(qiáng)度強(qiáng)、降解速率慢。體外實(shí)驗(yàn)[16]證實(shí)，透明質(zhì)酸芐基酯凝膠對(duì)軟骨細(xì)胞表型的維持具有優(yōu)勢(shì)且對(duì)細(xì)胞黏附和增殖具有誘導(dǎo)作用。Kon等[17]對(duì)50例Hyalograft C患者進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)5年的追蹤隨訪，結(jié)果顯示所有患者臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)均明顯好轉(zhuǎn)，MRI檢查顯示移植物邊緣整合和缺損填充良好，并發(fā)現(xiàn)有規(guī)律的運(yùn)動(dòng)對(duì)臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)、再生軟骨表面情況有積極的影響。Brix等[18]對(duì)53例Hyalograft C患者進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)平均9年的隨訪，結(jié)果顯示術(shù)后患者所有臨床康復(fù)指標(biāo)均顯著改善，其中10年隨訪組(13例)國(guó)際膝關(guān)節(jié)文獻(xiàn)委員會(huì)膝關(guān)節(jié)評(píng)估表(IKDC)評(píng)分由術(shù)前40.4分提高至74.7分(P<0.05)。盡管Hyalograft C治療效果得到廣泛肯定，但因無(wú)法提供足夠的證據(jù)說(shuō)明其獲益大于風(fēng)險(xiǎn)，Hyalograft C目前已從歐洲市場(chǎng)退出[19]。

2.2Bioseed C技術(shù)

Bioseed C技術(shù)的移植材料主要為纖維蛋白水凝膠，經(jīng)由聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、聚二惡烷烔等化學(xué)改造，改造后支架孔隙率增大、力學(xué)強(qiáng)度提高。該技術(shù)采取特殊的固定方式，即仔細(xì)清創(chuàng)修整軟骨缺損為矩形，將移植物裁剪成相匹配的形狀，移植物4個(gè)角經(jīng)可吸收線縫合至軟骨下骨來(lái)達(dá)到有效的固定作用，確保即使缺損周?chē)浌且浦参锊煌暾膊粫?huì)發(fā)生松動(dòng)[20]。Ossendorf等[21]報(bào)道40例Bioseed C患者2年隨訪結(jié)果，其中膝關(guān)節(jié)損傷與骨關(guān)節(jié)炎評(píng)分(KOOS)、Lysholm評(píng)分、改良辛辛那提膝關(guān)節(jié)評(píng)分和生活治療調(diào)查問(wèn)卷(SF-36)評(píng)分明顯提高，組織學(xué)活檢顯示移植物與周?chē)M織整合良好。Kreuz等[22]報(bào)道了52例Bioseed C患者術(shù)后平均4年的隨訪結(jié)果，其中KOOS、IKDC、Lysholm和ICRS評(píng)分較術(shù)前明顯提高，MRI檢查提示軟骨缺損填充良好，表明Bioseed C技術(shù)是修復(fù)膝關(guān)節(jié)局部退行性缺損的有效治療手段。

2.3NeoCart技術(shù)

NeoCart技術(shù)將軟骨細(xì)胞種于Ⅰ型膠原構(gòu)建的蜂巢樣基質(zhì)中并置于特制的模擬關(guān)節(jié)力學(xué)環(huán)境的反應(yīng)器培養(yǎng)1周，再體外三維靜態(tài)培養(yǎng)2周(必要時(shí)可達(dá)4周)，得到的移植物含有豐富的蛋白多糖和黏多糖，最后經(jīng)小關(guān)節(jié)切口植入缺損區(qū)，采用生物黏合劑固定[23]。Crawford等[24]首次報(bào)道了8例應(yīng)用NeoCart技術(shù)的患者，術(shù)后隨訪2年，結(jié)果IKDC評(píng)分明顯提高，MRI檢查顯示軟骨缺損填充良好。他們[25]在隨后進(jìn)行的美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)第2期臨床審核中對(duì)比了20例NeoCart患者與10例微骨折術(shù)患者，結(jié)果顯示NeoCart技術(shù)安全性類似微骨折術(shù)，卻具有更顯著的臨床效果。目前NeoCart技術(shù)尚處于FDA第3期臨床審核階段[26]。

2.4 Cartipatch技術(shù)

Cartipatch技術(shù)采用由瓊脂糖和藻酸鹽構(gòu)成的溫固化水凝膠為支架，該材料在室溫下為溶膠狀態(tài)，內(nèi)部具有豐富的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，回植時(shí)與軟骨細(xì)胞懸液均勻混合，被注射至軟骨缺損處后，體溫下可迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，最后以生物膠水固定[23]。瓊脂糖凝膠化后具有三維多孔結(jié)構(gòu)，但其防粘連特性可干擾細(xì)胞黏附，因此需與藻酸鹽等天然材料復(fù)合，降低其防粘連性且優(yōu)化支架的力學(xué)性能和成型性能[27]。Selmi等[28]報(bào)道了17例經(jīng)Cartipatch技術(shù)治療的軟骨缺損患者，分別從臨床、影像學(xué)、關(guān)節(jié)鏡下和組織學(xué)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，隨訪2年，結(jié)果所有患者臨床癥狀均得以顯著改善，平均國(guó)際關(guān)節(jié)鏡下軟骨修復(fù)評(píng)分為10分(最高12分)，13例行組織學(xué)檢查的患者中有8例(62%)可見(jiàn)顯著的透明軟骨，表明由瓊脂糖與藻酸鹽組成的水凝膠不僅可以修復(fù)較大、較深的軟骨缺損，而且在操作上較便捷。

2.5Novocart 3D技術(shù)

Novocart 3D技術(shù)以三維膠原-硫酸軟骨素為支架。硫酸軟骨素是共價(jià)連接在蛋白質(zhì)上的一類糖胺聚糖，廣泛分布于細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面。硫酸軟骨素經(jīng)膠原交聯(lián)化學(xué)改造后抗原性和降解速率降低，同時(shí)更能模擬軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的特性[29]。該技術(shù)使用生物可吸收螺釘固定，便于關(guān)節(jié)鏡下操作。Zak等[30]報(bào)道了23例Novocart 3D患者術(shù)后2年的隨訪結(jié)果，結(jié)果KOOS、IKDC、Tegne等評(píng)分明顯提高，MRI檢查顯示移植物填充良好。該技術(shù)目前尚缺乏中長(zhǎng)期隨訪研究結(jié)果。Niethammer等[31]對(duì)30例Novocart 3D患者隨訪3年，結(jié)果IKDC評(píng)分較術(shù)前明顯提高，MRI檢查顯示缺損區(qū)新生軟骨填充良好，信號(hào)與鄰近正常軟骨組織相似。

2.6CaReS技術(shù)

CaReS技術(shù)以鼠尾Ⅰ型膠原蛋白為支架，鼠尾膠原是天然的培養(yǎng)基，其濃度>1 mg/mL時(shí)可形成一定強(qiáng)度的三維凝膠[32]。該技術(shù)在低溫條件下將鼠尾膠原與軟骨細(xì)胞懸液均勻混合，加入自體血清，室溫下待生成凝膠后置于培養(yǎng)箱里培養(yǎng)2周。Schuttler 等[33]對(duì)15例CaReS患者隨訪4年，結(jié)果顯示IKDC評(píng)分、疼痛視覺(jué)模擬評(píng)分(VAS)、軟骨修復(fù)MR評(píng)分(MOCART)在后期顯著提高。Petri等[34]比較CaRes技術(shù)與微骨折術(shù)，尚未發(fā)現(xiàn)CaRes技術(shù)明顯的優(yōu)勢(shì)，其療效有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3支架材料

無(wú)論是經(jīng)典MACI技術(shù)，還是隨后出現(xiàn)的Hyalograft C、Bioseed C、NeoCart、CaReS等批準(zhǔn)臨床運(yùn)用的方法，它們所選用的支架主體都是天然材料，以軟骨基質(zhì)成分如膠原、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、纖維蛋白等居多[35]。這類物質(zhì)早已作為其他用途用于臨床治療，其生物相容性和安全性毋庸置疑。盡管人工材料力學(xué)性能優(yōu)于天然材料，但其安全性有待證實(shí)。目前唯一獲得FDA認(rèn)可的PLGA類人工合成材料也較少單一用于組織工程，通常復(fù)合其他天然材料來(lái)彌補(bǔ)支架所需的細(xì)胞識(shí)別信號(hào)及仿生效果[36]。

4結(jié)語(yǔ)

MACI是支架、種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子三大要素的有機(jī)結(jié)合。天然支架具有獨(dú)特的細(xì)胞識(shí)別信號(hào)、良好的生物相容性和仿生效果，目前眾多技術(shù)仍選用天然材料作為支架主體。有學(xué)者針對(duì)支架部分提出改進(jìn)，試圖發(fā)現(xiàn)或研發(fā)更適合軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)、能完美解決其去分化現(xiàn)象、更匹配的降解速率和優(yōu)越的過(guò)渡期生物力學(xué)性能的三維支架。水凝膠的出現(xiàn)、溫控和光敏材料的應(yīng)用使得關(guān)節(jié)鏡下注射修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨成為可能，并可縮短手術(shù)時(shí)間和減少術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率。盡管這些新型材料均有滿意的臨床療效，但目前為止尚未有哪種修復(fù)可以獲得健康軟骨的所有特性，且該技術(shù)缺乏大樣本、中長(zhǎng)期的隨訪結(jié)果。近期有學(xué)者研究種子細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題，其中胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶干細(xì)胞等備受關(guān)注，也有學(xué)者關(guān)注生物反應(yīng)器對(duì)構(gòu)建組織工程軟骨的優(yōu)勢(shì)。相信隨著多學(xué)科的交匯，將會(huì)出現(xiàn)更多解決軟骨修復(fù)的新技術(shù)。

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(收稿：2015-09-14; 修回：2015-12-23)

(本文編輯：盧千語(yǔ))

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.02.003

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81572198)、廣東省自然科學(xué)基金(2015A030313772)