耐甲氧西林金黃色葡萄球菌青霉素結(jié)合蛋白2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的克隆、表達(dá)及純化鑒定*

馬洪玉，蘭小鵬，陳　敏

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院檢驗(yàn)科,福建福州 350025)

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·論著·

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌青霉素結(jié)合蛋白2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的克隆、表達(dá)及純化鑒定*

馬洪玉，蘭小鵬，陳敏△

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院檢驗(yàn)科,福建福州 350025)

摘要:目的構(gòu)建編碼耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)青霉素結(jié)合蛋白2a (PBP2a)轉(zhuǎn)肽酶區(qū)基因片段的原核表達(dá)載體，并表達(dá)、純化及鑒定蛋白。方法從臨床標(biāo)本中分離鑒定MRSA，設(shè)計(jì)針對(duì)編碼PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)基因片段的引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的基因片段，克隆至pET28a(+)載體，雙酶切鑒定并測(cè)序，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS株；用0.7 mmol/L異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)后，利用Ni親和層析技術(shù)純化目的蛋白；蛋白免疫印跡法(WB)鑒定重組蛋白。結(jié)果重組表達(dá)載體經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，產(chǎn)物在預(yù)期大小處出現(xiàn)條帶，測(cè)序結(jié)果顯示有兩個(gè)堿基突變，無(wú)移碼突變。所表達(dá)的PBP2a蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和WB鑒定，在相對(duì)分子質(zhì)量38×103處可見(jiàn)一新生蛋白條帶。結(jié)論成功構(gòu)建了PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)原核表達(dá)載體，并獲得了高效表達(dá)，制備了高純度的目的蛋白。

關(guān)鍵詞:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；mecA基因；青霉素結(jié)合蛋白2a；轉(zhuǎn)肽酶區(qū)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是醫(yī)院感染的重要病原菌之一，該菌對(duì)多種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物具有內(nèi)在耐藥性，給臨床治療帶來(lái)嚴(yán)重困難[1-2]。主要耐藥機(jī)制為MRSA獲得mecA基因，編碼青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)，PBP2a與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物親和力很低，因而使得MRSA對(duì)大多數(shù)抗菌藥物耐藥[3]。PBP2a由N-末端跨膜區(qū)、非青霉素結(jié)合區(qū)和轉(zhuǎn)肽酶區(qū)3部分組成。本研究采用從臨床分離鑒定的MRSA菌株，應(yīng)用基因重組技術(shù)將編碼PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的DNA片段克隆至大腸桿菌表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的高效表達(dá)，并對(duì)重組蛋白進(jìn)行了純化和鑒定，為后續(xù)相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株來(lái)源MRSA臨床分離株、質(zhì)粒pET28a(+)均由本室保存；大腸桿菌DH5α及BL21(DE3)plysS株購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2材料與方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)所用試劑Taq MIX、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ及T4 DNA連接酶均購(gòu)自日本Takara公司；PCR純化、質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒購(gòu)自上海生物工程股份有限公司；Ni親和層析預(yù)裝柱購(gòu)自美國(guó)Novagen公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自杭州博日科技有限公司；凝膠成像儀購(gòu)自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；兔抗PBP2a抗體購(gòu)自Rio Ray公司。

1.3方法

1.3.1PCR擴(kuò)增目的基因片段根據(jù)已公布的mecA基因序列，由Invitrogen(上海)公司合成一對(duì)寡核苷酸引物，上游引物：5′-CGG GAT CCA CTA TTG ATG CTA AAG TTC A-3′；下游引物：5′-GGA ATT CGC AAC CCA CGT TAC CGG ATT G-3′[4]。用接種針挑取本院檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室保留的MRSA菌落，加入雙蒸水18 μL，Taq MIX 20 μL，上下游引物各1 μL，混勻，94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

1.3.2重組表達(dá)載體的構(gòu)建PCR所獲得的目的基因片段經(jīng)1%瓊酯糖凝膠電泳，按膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收純化后用BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，并與同樣酶切的pET28a(+)載體T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)菌。通過(guò)酶切鑒定篩選出陽(yáng)性重組子，并將陽(yáng)性重組子送至Invitrogen(上海)公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3.3重組蛋白的表達(dá)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)plysS，然后挑取單個(gè)菌落，接種至含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后，以1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮的含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至吸光度值(A值)為0.6，取1 mL作為對(duì)照，其余加100 mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.7 mmoL/L，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，取1 mL培養(yǎng)液離心收集細(xì)菌，重懸于50 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加等體積2×上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，取10 μL進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

1.3.4重組蛋白的復(fù)性將1 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接種于100 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，按上述方法誘導(dǎo)目的蛋白的產(chǎn)生；4 ℃離心收集沉淀物，將沉淀用40 mL的緩沖液A(20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，10 mmol/L乙二胺四乙酸，1% Triton X-100)重懸，冰浴中超聲破碎，10 000 r/min離心10 min收集沉淀；以40 mL的緩沖液A洗滌包涵體兩次，離心去上清，稱(chēng)量包涵體凈重；加入40 mL緩沖液B[50 mmol/L 3-環(huán)己基氨基-1-丙磺酸，pH11.0，3% N-十二烷基肌胺酸鈉和1 mol/L二硫蘇糖醇(DTT)]輕輕混勻，室溫孵育15 min，10 000 r/min離心10 min至溶液澄清。將含有可溶蛋白的上清轉(zhuǎn)入透析袋中，每次透析所用緩沖液體積為2 000 mL緩沖液C(0.02 mol Tris-HCl，pH8.5，0.1 mmol/L DTT)4 ℃透析3 h，透析兩次，以緩沖液D (即不加DTT的緩沖液C)繼續(xù)透析兩次，以加入終濃度分別為1.0、0.2 mmol/L的還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽緩沖液D，4 ℃透析過(guò)夜；4 ℃ 1 000 r/min離心10 min去除沉淀，0.45 μm濾器過(guò)濾。

1.3.5重組蛋白的純化預(yù)裝柱經(jīng)結(jié)合緩沖液(0.5 mol NaCl，5 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH7.9)平衡后，4 ℃條件下，將透析后的液體上樣，控制流速為10 mL/h，依次用10 mL結(jié)合緩沖液、10 mL漂洗緩沖液(0.5 mol NaCl，60 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH7.9)、5 mL洗脫緩沖液(0.5 mol NaCl，1 mol imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH7.9)洗柱，分別收集洗脫液。分別取10 μL洗脫液加入等量2×SDS上樣緩沖液，混勻，100 ℃煮沸5 min，SDS-PAGE電泳。

1.3.6蛋白免疫印跡法(WB)鑒定重組蛋白取5 μL純化蛋白液，加等體積2×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，SDS-PAGE電泳，以未誘導(dǎo)菌的提取液做對(duì)照，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、結(jié)合稀釋1 000倍兔抗PBP2a一抗、稀釋2 000倍的羊抗兔二抗體后，發(fā)光鑒定，標(biāo)定標(biāo)記物，進(jìn)行掃描。

2結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增目的基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，約1 000 bp附近可見(jiàn)清晰的擴(kuò)增條帶，與目的片段預(yù)期大小一致。見(jiàn)圖1。

M：DNA分子量標(biāo)記物。

圖1PCR擴(kuò)增目的基因片段

2.2重組表達(dá)載體的酶切鑒定和測(cè)序重組表達(dá)載體經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，產(chǎn)物在預(yù)期大小(1 026 bp)處出現(xiàn)條帶，見(jiàn)圖2。測(cè)序結(jié)果與基因文庫(kù)登錄的目的片段序列(GenBank：X52593)僅有兩個(gè)堿基位點(diǎn)不一致，無(wú)移碼突變，核酸同源性為99.8%。見(jiàn)圖2。

M：DNA分子量標(biāo)記物；1、2：非目的克隆酶切產(chǎn)物；3：目的克隆酶切產(chǎn)物。

圖2BamHⅠ/EcoRⅠ酶切重組表達(dá)載體

2.3重組蛋白的表達(dá)與純化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在相對(duì)分子質(zhì)量約38×103處新增明顯條帶，與理論相對(duì)分子質(zhì)量一致。0.7 mmoL/L IPTG誘導(dǎo)的蛋白條帶最深。見(jiàn)圖3(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

2.4重組蛋白的鑒定經(jīng)過(guò)WB純化的重組蛋白在38×103附近有明顯的陽(yáng)性條帶，而對(duì)照菌的提取液則為陰性。見(jiàn)圖4(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

3討論

自20世紀(jì)60年代報(bào)道MRSA以來(lái)，MRSA所致的醫(yī)院感染率逐年上升，成為全球關(guān)注的嚴(yán)重醫(yī)院和社區(qū)感染病原菌[5-6]。MRSA是多重耐藥菌，耐藥性的遺傳決定子為mec，長(zhǎng)約(30～50)×103，位于細(xì)菌染色體上，由mecA、mecI、mecRI及(20～40)×103的mec相關(guān)DNA 組成。mecA為結(jié)構(gòu)基因，編碼產(chǎn)生PBP2a蛋白。PBP2a含有668個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為78×103，該蛋白由N-末端跨膜區(qū)、非青霉素結(jié)合區(qū)和轉(zhuǎn)肽酶區(qū)3部分組成，其中轉(zhuǎn)肽酶區(qū)內(nèi)含β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物作用位點(diǎn)[7-8]，在細(xì)菌耐藥中起主要作用。

目前，MRSA感染的診斷和治療策略主要以PBP2a為靶標(biāo)[9-10]，PBP2a蛋白的表達(dá)是前提。本研究應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)基因片段1 026×103，測(cè)序結(jié)果與基因文庫(kù)登錄的目的片段序列僅有兩個(gè)堿基位點(diǎn)不一致，無(wú)移碼突變，核酸同源性為99.8%。在重組蛋白的表達(dá)中筆者做了大量的試驗(yàn)，使用不同表達(dá)載體，包括谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)表達(dá)載體的PGEX-4T、HIS表達(dá)載體的pet-22b、pet-28a。在不同的IPTG誘導(dǎo)濃度(0.4、0.7、1.0 mmoL/L)，不同的誘導(dǎo)時(shí)間(2、4、6、8、12 h)，不同的溫度(16、20、25、30、37 ℃)下檢測(cè)，均為包涵體表達(dá)的蛋白，證實(shí)在濃度0.7 mmoL/L的IPTG 37 ℃誘導(dǎo)6 h，蛋白的表達(dá)量最大，誘導(dǎo)其在大腸桿菌中高效表達(dá)。隨后應(yīng)用Ni親和層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行了純化，筆者優(yōu)化了溶解包涵體，結(jié)合、漂洗和洗脫條件，得到了高純度蛋白。

本實(shí)驗(yàn)所表達(dá)的PBP2a蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳和WB鑒定，在相對(duì)分子質(zhì)量38×103處均可見(jiàn)一新生蛋白條帶，與MRSA-PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的相對(duì)分子質(zhì)量相吻合，說(shuō)明已成功誘導(dǎo)了PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)蛋白，對(duì)PBP2a的分子生物學(xué)特性做了進(jìn)一步探索，為MRSA感染的臨床診斷和防治方法的研究提供了理論基礎(chǔ)，將極大地推進(jìn)MRSA感染難題的攻克。

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Cloning,prokaryotic expression,purification and identification of the transpeptidase domain of penicillin binding protein 2a of methicillin-resistant Staphylococcus aureus*

MaHongyu，LanXiaopeng，ChenMin△

(DepartmentofClinicalLaboratory,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Fuzhou,Fujian350025,China)

Abstract:ObjectiveTo construct the prokaryontic expression vector of the gene fragment which encodes the transpeptidase domain of penicillin binding protein 2a(PBP2a) of methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA),and to express,purify and identify the objective protein.MethodsStrains of MRSA were isolated and identified from clinical samples,according to the sequence of mecA gene recorded in GenBank,the primers of mecA fragment which encoded the transpeptidase domain of PBP2a was designed.The gene fragment from MRSA was amplified by using polymerase chain reaction(PCR) and cloned into pET28a(+) plasmid.After being identified by enzyme digestion and sequencing,the recombinant plasmid was transformed into the strain of Escherichia coli BL21(DE3)plysS.The expression of transpeptidase domain of PBP2a was induced by 0.7 mmol/L IPTG,the expressed products were purified by using Ni afinity chromatography,then were analyzed by using Western blot.ResultsThe recombinant expression vector was digested by BamHⅠ and EcoRⅠ,and the products were at the expected size.The result of sequencing showed two bases undergoing mutation,while there were no frameshift mutations.The expressed protein was identified by using SDS-PAGE and Western blot,a new protein band was visible at the relative molecular mass of 38×103.ConclusionThe corresponding prokaryotic expression vector is successfully constructed,and the transpeptidase domain of PBP2a is successfully expressed and purified．

Key words:methicillin-resistant Staphylococcus aureus；mecA gene；penicillin binding protein 2a；transpeptidase domain

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃社會(huì)發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目(2012Y0058)。

作者簡(jiǎn)介:馬洪玉，女，主管檢驗(yàn)技師，主要從事臨床微生物與檢驗(yàn)研究。 △通訊作者，E-mail：fzcmin@qq.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.008

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)05-0597-03

(收稿日期：2015-10-22)