組織S100Al mRNA和Snail mRNA檢測在卵巢疾病中的應用

劉亞紅，孫蓓

(陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院婦二科，陜西 咸陽 712000)

組織S100Al mRNA和Snail mRNA檢測在卵巢疾病中的應用

劉亞紅，孫蓓

(陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院婦二科，陜西 咸陽 712000)

目的 探討組織鈣結合蛋白S100Al mRNA和鋅指轉錄因子Snail mRNA檢測在卵巢疾病中的臨床應用。方法選取2013年3月至2015年3月我院經(jīng)病理確診的卵巢病變組織標本共68例，通過RT-PCR技術檢測卵巢良性囊腺瘤(良性腫瘤組)、交界性囊腺瘤(交界性腫瘤組)和卵巢囊腺癌(卵巢癌組)組織S100Al mRNA和Snail mRNA的表達，并測定各組血清癌胚抗原(CEA)、糖類抗原125(CA125)及人附睪分泌蛋白(HE4)水平，比較三組患者以上指標的變化。結果卵巢癌組組織S100Al mRNA和Snail mRNA的表達量與交界性腫瘤組和良性腫瘤組比較明顯增高，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，交界性腫瘤組與良性腫瘤組比較明顯增高，差異也有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；卵巢癌和交界性腫瘤組S100Al mRNA和Snail mRNA相對表達量具有相關性(r=0.629、0.571，P＜0.01)，組織S100Al mRNA和Snail mRNA分別與血清CA125及HE4呈現(xiàn)相關性(r=0.632、0.587，P＜0.01；r=0.638、0.617，P＜0.01)。結論聯(lián)合檢測組織S100Al mRNA和Snail mRNA在卵巢良性囊腺瘤、交界性囊腺瘤和卵巢囊腺癌病變組織中的表達，可增加卵巢囊腺癌的早期檢出率，為上皮性卵巢疾病的鑒別診斷提供新的思路。

卵巢良性囊腺瘤；卵巢交界性囊腺瘤；卵巢囊腺癌；S100Al mRNA；Snail mRNA

卵巢上皮性腫瘤是最常見的卵巢腫瘤，占原發(fā)性卵巢腫瘤的50%～70%，占卵巢惡性腫瘤的85%～90%[1]。上皮卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤之一。卵巢癌早期癥狀不典型，在普通人群篩查中，無論是卵巢癌首選檢測標志物癌胚抗原還是B超都不能夠有效診斷[2]。國內外統(tǒng)計資料顯示，早期診斷的卵巢癌患者，手術及介入治療，90%的患者能存活5年以上，而已發(fā)生轉移的晚期卵巢癌患者5年生存率不足30%[3]。因此提高卵巢癌的早期診斷率，及對卵巢癌全面的術前評估對于卵巢癌治療處理及預后至關重要[3]。S100Al是鈣結合蛋白S100家族的成員，其與多種癌癥相關[2]。鋅指蛋白Snail是胚胎發(fā)育中促進中胚層和神經(jīng)嵴形成的轉錄因子。SNAI1通過抑制E-鈣黏蛋白的表達誘導上皮間質轉化的發(fā)生，導致癌細胞喪失上皮特性，富于侵襲和轉移特性[4]。本研究用RT-PCR技術檢測68例卵巢良性囊腺瘤、交界性囊腺瘤和卵巢囊腺癌組織中Snail mRNA和S100Al mRNA的表達情況，探討兩個標志物在卵巢癌中表達的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年3月至2015年3月我院經(jīng)病理確診的卵巢病變組織標本共68例，患者年齡32～81歲，平均53.5歲。其中卵巢良性腫瘤組織(良性腫瘤組)20例，卵巢囊腺癌(卵巢癌組)30例，交界性囊腺瘤(交界性腫瘤組)18例。每例患者手術過程中均取適量卵巢組織。上皮性卵巢癌按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO) 2000年分期：I～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期18例；按WHO分化標準：高分化(G1)9例、中、低分化(G2、G3)21例。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，并得到所有研究對象的知情。

1.2 研究方法 采用RT-PCR方法研究卵巢良性囊腺瘤、交界性囊腺瘤和卵巢囊腺癌組織中鈣結合蛋白S100Al mRNA和鋅指轉錄因子Snail mRNA表達狀況，采用酶聯(lián)免疫吸附反應測定各組血清癌胚抗原(CEA)、糖類抗原125(CA125)及人附睪分泌蛋白4(HE4)水平。

1.2.1 儀器、試劑和引物 RNA提取來自美國Invitrogen公司。lightCycler熒光PCR儀來自德國Roche公司。PCR試劑盒來自上海久盛醫(yī)療用品有限公司。

1.2.2 細胞分離和總RNA的提取 采用Trizol法提取組織中的總RNA，在分光光度計上檢測A260/280的比值以驗證RNA的純度。

1.2.3 PCR擴增 用Primer5軟件設計引物，Snail正義鏈：5′-AATCGGAAGCCTAACTACAGCG-3′，反義鏈：5′-GTCCCAGATGAGCATTGGCA-3′，擴增產(chǎn)物大小350 bp。S100Al的引物序列為：正義鏈5′-CAGGAATTCATGGCCTTTGT-3′，反義鏈5′-ATGATGCAGGCCGTTAAAAC-3′，產(chǎn)物長度365 bp。β-actin作為內參照，β-actin的引物序列為：正義鏈5′-AGGCACTGGGGCTTCATCTGAC-3′，反義鏈5′-GCCTTCCATCCC TTTGCTTAG-3′；產(chǎn)物長度650 bp。反應條件：95℃，10 min→95℃，30 s→52℃，30 s→72℃，30 s，40個循環(huán)→72℃，10 min→4℃保存。

1.2.4 基因片段序列測定和分析 使用測序儀對PCR產(chǎn)物進行序列測定。將測序結果通過BLAST應用軟件與GenBank中的已知序列進行同源性比較。

1.2.5 mRNA表達量測定 對擴增目的片段進行凝膠電泳，通過紫外光凝膠成像系統(tǒng)進行掃描并記錄，用四維成像處理系統(tǒng)，測定各組的cDNA的特異性，RNA表達量與內參照的比值代表mRNA表達量。S100Al mRNA和Snail mRNA電泳圖見圖1、圖2。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用t檢驗，相關性分析采用Pearson法，采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評價組織S100Al mRNA和Snail mRNA的臨床意義，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 不同病變組織Snail mRNA表達

圖2 不同病變組織S100Al mRNA表達

2 結 果

2.1 血清腫瘤標志物檢測結果比較 卵巢癌組中的血清CEA、CA125及HE4水平分別與交界性腫瘤組和良性腫瘤組比較均增高,其差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表1。

表1 各組血清腫瘤標志物檢測結果(±s)

表1 各組血清腫瘤標志物檢測結果(±s)

注：與良性腫瘤組比較，t=7.82、17.37、21.38，aP＜0.01；t=20.36、43.67、57.32，bP＜0.01；與交界性腫瘤組比較，t=17.53、37.22、47.93，cP＜0.01。

組別 例數(shù)CEA(ng/ml)CA125(U/ml)HE4(pmol/L)良性腫瘤組交界性腫瘤組卵巢癌組20 18 30 1.19±1.12 7.28±10.73a32.69±17.58bc12.33±5.71 69.07±170.37a339.7±77.38bc10.09±1.68 83.33±57.56a320.07±37.27bc

2.2 組織S100Al mRNA和Snail mRNA表達率和表達量比較 卵巢癌組兩標志物交界性腫瘤組和良性腫瘤組比較明顯增高差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，交界性腫瘤組與良性腫瘤組比較也增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表2。

表2 各組組織S100AlmRNA和SnailmRNA表達量比較(±s)

表2 各組組織S100AlmRNA和SnailmRNA表達量比較(±s)

注：與良性腫瘤組比較，t=12.39、10.67，aP＜0.01；t=33.62、32.57，bP＜0.01；與交界性腫瘤組比較，t=29.61、27.73，cP＜0.01。

組別 例數(shù)Snail mRNA S100Al mRNA良性腫瘤組交界性腫瘤組卵巢癌組20 18 30 0.26±0.06 0.43±0.08a1.13±0.14bc0.21±0.05 0.37±0.07a1.06±0.12bc

2.3 相關性分析 S100Al mRNA和Snail mRNA在卵巢癌和交界性腫瘤組織中的表達量具有相關性(r=0.629、0.571，P＜0.01)。在卵巢癌和交界性腫瘤組織S100Al mRNA和Snail mRNA表達量與血清CA125及HE4水平有明顯相關性(r=0.632、0.587，P＜0.01；r= 0.638，0.617，P＜0.01)。

2.4 利用ROC曲線來評價兩項標志物的價值 卵巢癌組以交界性腫瘤組為參照，組織S100Al mRNA和Snail mRNA的AUC分別為0.803，0.768，P＜0.01，聯(lián)合檢測組織S100Al mRNA和Snail mRNA的AUC為0.953，P＜0.01，即組織S100Al mRNA和Snail mRNA在鑒別卵巢癌和卵巢交界性腫瘤疾病中有診斷意義。單獨檢測組織S100Al mRNA和Snail mRNA分別用于診斷交界性腫瘤時，以對照組為參照的AUC分別為0.537、0.607，P＜0.01，聯(lián)合檢測兩標志物的AUC為0.783，P＜0.01。即組織S100Al mRNA和Snail mRNA在鑒別卵巢交界性腫瘤和良性腫瘤疾病中有診斷意義，見圖3～圖6。

圖3 檢測S100Al mRNA和Snail mRNA診斷卵巢癌和卵巢交界性腫瘤的ROC曲線

圖4 聯(lián)合檢測S100Al mRNA和Snail mRNA診斷卵巢癌和卵巢交界性腫瘤的ROC曲線

圖5 檢測S100Al mRNA和Snail mRNA診斷卵巢交界性腫瘤和良性腫瘤的ROC曲線

圖6 聯(lián)合檢測S100Al mRNA和Snail mRNA診斷卵巢交界性腫瘤和良性腫瘤的ROC曲線

3 討 論

研究證實，S100Al蛋白在心臟疾病中有著重要作用，其與多種神經(jīng)病變及多種癌癥均相關[2]。Sviatoha等[5]的研究證明，在多種惡性腫瘤中都存在S100Al表達上調的現(xiàn)象，所以，S100A1或許可以作為鑒別良惡性腫瘤組織的標志物。有報道認為，S100A1在正常卵巢組織中的表達較少，但在卵巢癌中的表達明顯增高[2]。本研究顯示S100A1在卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達，其與交界組和對照組的比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，推測S100A1的高表達與卵巢癌的發(fā)生相關，交界性腫瘤組的S100A1表達低于卵巢癌組(P＜0.01)，提示其在轉移和深部浸潤等方面的機會較小。進一步研究顯示交界組S100A1表達高于對照組(P＜0.01)，提示交界性腫瘤可能存在有低度惡性潛能。S100A1在卵巢癌和交界性腫瘤中的表達差異提示其可作為卵巢癌的早期診斷的分子標志物，S100A1在腫瘤發(fā)生過程中的分子機制尚不清楚[6]，這也是我們接下來所要探索的問題，這對腫瘤的診斷和治療具有非常積極的意義。

近年來Snail在腫瘤發(fā)生的作用中越來越受到人們的關注。Parker等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在預后較差的早期乳腺癌患者的癌細胞中Snail呈現(xiàn)高水平表達，在侵襲性乳腺癌的上皮和內皮細胞中均發(fā)現(xiàn)Snail的過表達，而在正常的乳腺中則沒有表達。Yokoyama等[8]研究發(fā)現(xiàn)，侵襲力強的口腔鱗癌細胞中發(fā)現(xiàn)有Snail的高表達，而侵襲力弱的口腔鱗癌細胞中幾乎檢測不到Snail的表達。有研究采用免疫組織化學檢測83例卵巢囊腺瘤、不同分化程度的卵巢癌組織中Snail的表達情況，發(fā)現(xiàn)Snail在卵巢癌組織中的表達顯著高于卵巢囊腺瘤[9]。本研究通過RT-PCR技術檢測不同卵巢組織Snail的表達發(fā)現(xiàn)，Snail在卵巢癌組織中的表達顯著高于交界性腫瘤組和對照組(P＜0.01)，提示Snail可以作為卵巢癌早期診斷的標志物。Snail表達在交界性腫瘤組和對照組間的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，提示Snail檢測可能為卵巢腫瘤的手術治療提供依據(jù)。

S100Al mRNA和Snail mRNA在卵巢癌和卵巢交界性腫瘤組織中的表達量具有相關性(P＜0.01)，在上述兩組中S100Al mRNA和Snail mRNA表達量與血清CA125及HE4水平有明顯相關性，提示兩標志物與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關。在卵巢癌和交界性腫瘤這兩種疾病的鑒別診斷中有一定的意義。利用ROC曲線評價兩標志物的結果顯示，組織S100Al和Snail檢測在鑒別卵巢癌和卵巢交界性腫瘤疾病中有診斷意義(P＜0.01)。單獨檢測組織兩標志物對鑒別卵巢交界性腫瘤和卵巢良性腫瘤有診斷意義(P＜0.01)。

綜上所述，組織S100Al和Snail的檢測可應用于上皮性卵巢腫瘤的鑒別診斷，并為卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。

[1]謝幸,茍文麗.婦產(chǎn)科學[M].8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013: 326-327.

[2]牟紅新,王婕,張萍.鈣結合蛋白S100Al在卵巢癌中的表達及意義[J].中國計劃生育學雜志,2013,21(8):524-527.

[3]陳燕,林鶯鶯,鄭瑜宏,等.血清HE4、CA125和ROMA指數(shù)評估卵巢癌風險性的初步評價[J].中國免疫學雜志,2013,29(2): 168-174.

[4]Olmeda D1,Moreno-Bueno G,Flores JM,et al.Snail is required for tumor growth and lymph node metastasis of human breast carcinoma DA-MB-231 cells[J].Cancer Res,2007,67(24):11721-11731.

[5]Sviatoha V,Tani E,KIeina R,et al.Immunohistochemical analysis of the S100A1,S100B,CD44 and Bcl-2 antigens and the rate of cell proliferation assessed by Ki-67 antibody,in benign and malignant melanocytic tumours[J].Melanoma Res,2010,20(2):118-125.

[6]翁達飛,章宜芬.鈣結合蛋白SIOOAl在腎細胞腫瘤中的研究進展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2009,17(7):1375-1377.

[7]Parker BS,Argani P,Cook BP,et al.Alterations in vascular gene expression in invasive breast carcinoma[J].Cancer Res,2004,64: 7857-7866.

[8]Yokoyama K,Kamata N,Hayashi E,et al.Reverse correlation of E-cadherin and Snail expression in oral squarnous cell carcinoma cells in vitro[J].Oral Oncd,2001,37(1):65-71.

[9]帥智峰,劉婷,于秀文,等.轉錄因子SNAI1與卵巢癌組織惡性表型之間的關系[J].中國老年學雜志,2014,34(5):2348-2350.

Application of detecting S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues in the patients with ovarian diseases.

LIU Ya-hong,SUN Bei.The Second Departerment of Gynaecology,the Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712000,Shaanxi,CHINA

Objective To explore the application of detecting S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues in the patients with ovarian disease.MethodsA total of tissue specimens from ovarian disease diagnosed by pathological section were selected from March 2013 to March 2015.The expression of S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues was detected in the ovarian benign cystic adenoma(benign tumor group),borderline cystic adenoma(borderline tumor group)and ovarian cystadenocarcinoma(ovarian cancer group)by RT-PCR technique,as well as the levels of serum carcino-embryonic antigen(CEA),carbohydrate antigen 125(CA125),and human epididymis secretory protein 4(HE4). The changes of the above indicators were compared among the three groups.ResultsThe expression rates of S100Al mRNA and Snail mRNA were significantly higher in ovarian cancer group than borderline tumor group and the benign tumor group(P＜0.01),and also in borderline tumor group than benign tumor group(P＜0.01).The relative expressions of S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues were correlated in the ovarian cancer group and the borderline tumor group (r=0.629,0.571,P＜0.01),and the two markers were correlated with the levels of serum CA-125 and HE4(r=0.632, 0.587,P＜0.01;r=0.638,0.617,P＜0.01).ConclusionJoint detection of expression of S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues in the ovarian benign cystic adenoma,borderline cystic adenoma and ovarian cystadenocarcinoma can increase the early detection rate of ovarian cystadenocarcinoma,providing a new thought for the differential diagnosis of the ovarian diseases.

Ovarian benign cystic adenoma;Borderline cystic adenoma;Ovarian cystadenocarcinoma;S100Al mRNA;Snail mRNA

R711.75

A

1003—6350（2016）07—1051—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.07.007

2015-09-18)

劉亞紅。E-mail：280310216@qq.com