抗體親和力試驗(yàn)的研究進(jìn)展

藍(lán)翊文 秦 月

(1 中華人民共和國憑祥出入境檢驗(yàn)檢疫局，憑祥市 532600，E-mail：735292951@qq.com；2 廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，南寧市 530028)

綜 述

抗體親和力試驗(yàn)的研究進(jìn)展

藍(lán)翊文1秦 月2

(1 中華人民共和國憑祥出入境檢驗(yàn)檢疫局，憑祥市 532600，E-mail：735292951@qq.com；2 廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，南寧市 530028)

近年來，不少學(xué)者應(yīng)用快速、準(zhǔn)確、敏感的抗體親和力試驗(yàn)鑒別病原體的原發(fā)感染和既往感染，解決相關(guān)疾病由于免疫等原因出現(xiàn)不典型癥狀的難題，為臨床制定預(yù)防和治療措施提供科學(xué)依據(jù)?？贵w親和力檢測(cè)技術(shù)的日益成熟，為疾病檢測(cè)開啟了新篇章。本文對(duì)近年來該技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究及應(yīng)用作一綜述。

抗體親和力；抗原；感染；免疫；綜述

抗體親和力是指抗體分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的抗原表位之間存在的引力，是抗原抗體之間固有的結(jié)合力，代表了兩者之間特異結(jié)合的緊密程度。抗體隨著機(jī)體初次接觸抗原時(shí)間的推移而逐漸成熟，初期抗體與抗原結(jié)合力較弱，即為低親和力抗體，隨著抗體的成熟，其親和力增加；當(dāng)加入能降低抗原抗體結(jié)合力的物質(zhì)(如尿素)時(shí)，低親和力抗體被洗脫，而高親和力抗體基本不受影響[1]。借此原理能建立檢測(cè)抗體親和力的方法，根據(jù)其的強(qiáng)弱可以大致判斷病原體感染的時(shí)間，確定是初次感染，即原發(fā)感染，或者是既往感染(包括繼發(fā)感染)。

抗體親和力因具有快速、準(zhǔn)確、敏感的特點(diǎn)而備受學(xué)者關(guān)注。近年來，不少學(xué)者應(yīng)用抗體親和力試驗(yàn)鑒別病原體的原發(fā)感染和既往感染，解決相關(guān)疾病由于免疫等原因出現(xiàn)不典型癥狀的難題，為制定預(yù)防和治療措施提供科學(xué)依據(jù)。不僅如此，根據(jù)其鑒別原發(fā)/繼發(fā)感染的特點(diǎn)，抗體親和力試驗(yàn)還可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)宮內(nèi)感染的發(fā)生，以便臨床及時(shí)采取處置措施，降低新生兒出生缺陷的發(fā)生率[2-4]?？贵w親和力檢測(cè)技術(shù)的日益成熟，為疾病檢測(cè)開啟了新篇章。本文對(duì)近年來該技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究及應(yīng)用作一綜述。

1 抗體親和力試驗(yàn)的原理與檢測(cè)方法

1.1 基本原理 抗體親和力試驗(yàn)前身是1989年Hedman等[5]為產(chǎn)前診斷風(fēng)疹病毒而建立的尿素變性試驗(yàn)。其基本原理是人體初次接觸抗原后，隨著時(shí)間推移B細(xì)胞不斷成熟，逐漸生成高親和力抗體；在尿素變性處理下，免疫初期產(chǎn)生的低親和力抗體會(huì)從抗原抗體復(fù)合物中解離出來，而后期產(chǎn)生的高親和力抗體仍與抗原牢固結(jié)合。通過低親和力及高親和力抗體的構(gòu)成比可有效判別初次感染和既往感染。

1.2 常規(guī)檢測(cè)方法 以Hedman等[5]發(fā)明的測(cè)定風(fēng)疹病毒抗體親和力的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法最具代表性：(1)在包被好風(fēng)疹病毒抗原的酶標(biāo)板中加入8 mol/L的尿素溶液；(2)血清樣本經(jīng)磷酸鹽緩沖液(phophate buffer solution，PBS)-Tween緩沖液1 ∶100稀釋后加入酶標(biāo)板中，每份血清平行加兩孔，37℃反應(yīng)2 h后，一孔用PBS-Tween緩沖液洗滌3次，另一孔用加有8 mol/L尿素的PBS-Tween溶液洗滌3次，均每次浸泡5 min；(3)加入抗RV-IgG的堿性磷酸酶，37℃反應(yīng)1 h，未被洗脫的抗RV-IgG則能與之結(jié)合，后用PBS-Tween洗滌3次，每次浸泡5 min；(4)加入顯色劑后用NaOH 終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值(OD值)。計(jì)算親和力指數(shù)(avidity index，AI)，AI=經(jīng)尿素處理的樣本OD值/相應(yīng)未經(jīng)尿素處理的樣本OD值×100%。1.3 AI的臨床意義 AI值大小反映出特異性抗體的親和力高低，應(yīng)用到臨床上可判斷獲得性感染時(shí)間的長短。目前針對(duì)抗體親和力檢測(cè)研究的文獻(xiàn)大多采用Hedman等[5]報(bào)告的判定標(biāo)準(zhǔn)：AI<30%為低親和力抗體，表示原發(fā)感染；30%～50%為中等親和力抗體，表示可能與病原體既往原發(fā)感染有關(guān)；AI>50%為高親和力抗體，表示既往感染。這一標(biāo)準(zhǔn)也同樣被應(yīng)用到其他病原體的檢測(cè)上，如Tuokko等[6]對(duì)麻疹病毒的檢測(cè)，其也是以AI<30%判定為低親和力抗體，AI>50%判定為高親和力抗體。

2 抗體親和力試驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展

2.1 變性劑的使用 尿素是親和力試驗(yàn)中最常用的變性劑，早期研究發(fā)現(xiàn)6 mol/L和8 mol/L尿素均能有效鑒別近期感染和既往感染[7]。而Condorelli等[8]對(duì)6 mol/L和8 mol/L尿素的洗脫效果比較發(fā)現(xiàn)，使用6 mol/L尿素時(shí)，風(fēng)疹患者在出疹后第3天和第46天的AI由16%上升至51%；而使用8 mol/L尿素時(shí)，親和力由13%變?yōu)?6%，親和力上升緩慢，說明6 mol/L尿素能在感染后更早的檢測(cè)出低親和力抗體。此后的實(shí)驗(yàn)較多以6 mol/L尿素代替8 mol/L尿素。

其他變性劑如異硫氰酸胍、檸檬酸、硫氰酸銨、二乙胺和鹽酸胍等在抗體親和力試驗(yàn)中亦有使用。異硫氰酸胍腐蝕性強(qiáng)，對(duì)儀器損害大；檸檬酸(pH=3.0)解離效率好，腐蝕性小，對(duì)儀器損害小，相對(duì)較安全[9]。有學(xué)者將變性劑硫氰酸銨、二乙胺、鹽酸胍與尿素進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)[10]：8 mol/L尿素組敏感性為 63.6%(7/11)，特異性為95.0%(19/20)； 35 mmol/L二乙胺組敏感性為72.2%(8/11)，特異性為95.0%(19/20)；4 mol/L鹽酸胍組敏感性為63.6%(7/11)，特異性為80.0%(16/20)；3 mol/L硫氰酸銨組敏感性為9.0%(1/11)，特異性為100%(20/20)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：35 mmol/L二乙胺較8 mol/L尿素效果好，其余兩種變性劑效果不佳，但由于二乙胺極度易燃，具腐蝕性、強(qiáng)刺激性，可致人體灼傷，故實(shí)際使用效果沒有尿素好。2.2 血清稀釋度的選擇 在弓形體AI試驗(yàn)中，Bonyadi等[11]按商品化試劑盒要求，對(duì)待檢樣本做初始稀釋后，繼續(xù)按1/3、1/6、1/9和1/18倍數(shù)稀釋血清，各稀釋血清分尿素處理組和未處理組，再進(jìn)行余下的ELISA反應(yīng)和測(cè)定計(jì)算AI值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)樣本中的特異性IgG抗體初始濃度大時(shí)，其相應(yīng)的最佳稀釋度也越高；提示樣本中抗體起始濃度的高低直接影響到其AI值的大小，選擇最佳的樣本稀釋度可避免高濃度IgG抗體樣本可能導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。

Jenum等[12]弓形體AI檢測(cè)試驗(yàn)中也遇到此問題，于是將血清標(biāo)本分別做兩個(gè)系列稀釋，一組做1 ∶50、1 ∶200和1 ∶800稀釋，然后用6 mol/L尿素洗脫來測(cè)定其ELISA的OD值；另一組做1 ∶200、1 ∶800和1 ∶3 200稀釋，但用試劑盒所配洗液洗脫測(cè)其OD值。最后將這兩組OD值帶入專門編制的終點(diǎn)滴度法公式，來計(jì)算其AI值。此方法解決了待檢樣本中抗體總量不同導(dǎo)致親和力測(cè)定結(jié)果不同的問題。

2.3 AI臨界值的設(shè)定 雖然Hedman等[5]對(duì)風(fēng)疹病毒抗體AI臨界值設(shè)定的思路同樣適用于其他病原體感染分析，但不同的待檢病原體、不同的實(shí)驗(yàn)條件及不同的試驗(yàn)方法，都會(huì)有各自特定的AI臨界值。Revello等[13]以近期感染(<90 d)和過去感染(≥90 d)及反復(fù)感染人群為對(duì)象，研究巨細(xì)胞病毒感染的AI臨界值設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。按試劑盒要求以AI臨界值<20%判定為低親和力時(shí)，其判斷近期感染的靈敏度為92.8%；而若將AI臨界值改為<30%，則靈敏度變?yōu)?00%，而且檢測(cè)的特異度不變?？梢夾I臨界值隨試驗(yàn)不同而改變，應(yīng)根據(jù)不同的試驗(yàn)條件摸索出對(duì)應(yīng)的臨界值標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 其他檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展 除了傳統(tǒng)尿素變性法外，限制性抗原親和力酶聯(lián)法(limiting antigen avidity enzyme immunoassay，Lag-Avidity EIA)和間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)亦有應(yīng)用。Lag-Avidity EIA法[14]原理為：抗原濃度較高時(shí)，高親和力和低親和力抗體的均有機(jī)會(huì)與抗原結(jié)合；當(dāng)抗原濃度低時(shí)，抗原首先選擇與高親和力抗體結(jié)合，而低親和力的抗體與抗原結(jié)合不穩(wěn)定，甚至不能與抗原結(jié)合。但是包被極低濃度的抗原難度較大，且檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定。經(jīng)試驗(yàn)，Lag-Avidity EIA法找到的最佳包被抗原濃度為0.063 μg/ml，在此濃度下，低親和力抗體與抗原結(jié)合不牢固，且在加入pH為3.0的檸檬酸后，能進(jìn)一步阻止低親和力抗體與抗原結(jié)合，而高親和力抗體不受影響。據(jù)此區(qū)分低親和力和高親和力抗體，來判斷原發(fā)感染和既往感染。有學(xué)者[15]對(duì)比傳統(tǒng)尿素法和Lag-Avidity EIA法檢測(cè)艾滋病抗體陽轉(zhuǎn)者血清的親和力變化情況，發(fā)現(xiàn)這兩種檢測(cè)方法有較好一致性；但AI法要求平行雙孔，而Lag-Avidity EIA法只需單孔檢測(cè)，操作相對(duì)簡單。IFA法用熒光標(biāo)記的抗IgG抗體代替酶標(biāo)記的抗IgG抗體，與待測(cè)血清中的IgG抗體結(jié)合反應(yīng)后，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果[16]。由于熒光色澤與背景色澤對(duì)比鮮明，含低親和力IgG抗體的血清用尿素處理后，可觀察到熒光強(qiáng)度明顯下降。實(shí)驗(yàn)相關(guān)性和一致性分析表明，低親和力IgG抗體水平與IgM抗體水平顯著相關(guān)(P<0.05)，且一致性較好。但結(jié)果易受非特異熒光的干擾，需設(shè)計(jì)較多的試驗(yàn)對(duì)照。

3 抗體親和力試驗(yàn)的應(yīng)用

3.1 鑒別原發(fā)感染 目前有較多種類的傳染病原發(fā)感染檢測(cè)應(yīng)用了抗體親和力試驗(yàn)，如風(fēng)疹病毒[5]、巨細(xì)胞病毒[1-2，4]、弓形體[3]、艾滋病病毒[17]、單純皰疹病毒[18]等的檢測(cè)。在以往的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中，IgM陽性為判斷新近感染和活動(dòng)期感染的指標(biāo)。但在一些病原體被清除后，IgM抗體可能于較長時(shí)間以低濃度狀態(tài)存在；而另一些病原體在急性感染后，IgM抗體較早消失。因此，IgM抗體檢測(cè)存在出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果的可能。而且在繼發(fā)感染時(shí)也可能出現(xiàn)IgM抗體，故單靠IgM抗體判斷病原體的原發(fā)感染有一定的局限性[19]。另外，采集急性期和恢復(fù)期雙份血清，恢復(fù)期IgG抗體滴度在急性期的4倍以上亦可判斷是否為新近感染。但患者難于接受雙份血清的采集，且間隔較長時(shí)間的采樣也較難實(shí)施[20]。相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)如PCR法亦可作為原發(fā)感染的輔助檢測(cè)手段，但其檢測(cè)的時(shí)效性受限于病原被機(jī)體清除前，且病原體如被長期攜帶則無法鑒別。

隨著抗體親和力試驗(yàn)技術(shù)的不斷成熟，其被認(rèn)為是判斷原發(fā)感染較為可靠的診斷方法。有研究表明[21]：在巨細(xì)胞病毒IgM陽性患者中只有14%～18%能檢出低親和力IgG，在判斷是否為巨細(xì)胞病毒近期感染時(shí)，抗體親和力試驗(yàn)的特異性明顯高于單純IgM抗體檢測(cè)。有學(xué)者研究認(rèn)為懷孕6～18周的巨細(xì)胞病毒IgG親和力試驗(yàn)診斷原發(fā)感染敏感度為100%，而IgM的診斷敏感度只有69%[22]。因此，抗體親和力試驗(yàn)不僅可鑒別初次感染和二次感染，還可排除初次感染后幾個(gè)月或幾年殘存有IgM抗體的可能。

3.2 優(yōu)生優(yōu)育 抗體親和力檢測(cè)技術(shù)在診斷宮內(nèi)感染及優(yōu)生優(yōu)育方面應(yīng)用最廣。風(fēng)疹病毒、人巨細(xì)胞病毒和弓形體這類病原體在人類多呈無癥狀感染或亞臨床癥狀，孕婦感染此類病毒后，特別是早期原發(fā)感染，易通過胎盤傳給胎兒，造成新生兒先天畸形，視力聽力障礙和智力障礙等嚴(yán)重癥狀。前瞻性研究發(fā)現(xiàn)[23]：我國人巨細(xì)胞病毒陽性母親所生小孩至周歲時(shí)人巨細(xì)胞病毒感染率達(dá)85.1%，懷孕早期感染人巨細(xì)胞病毒的嬰兒約15%～20%將終生殘疾[24]。因此對(duì)此類病毒原發(fā)感染的臨床評(píng)估極其重要。李牧等[25]對(duì)中晚期孕婦行弓形體IgG抗體親和力檢測(cè)，并對(duì)胎兒或新生兒臍血進(jìn)行弓形體IgM檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性宮內(nèi)感染率(53.45%)明顯高于繼發(fā)性宮內(nèi)感染率(22.73%)；活動(dòng)性宮內(nèi)感染率(45.00%)高于非活動(dòng)性宮內(nèi)感染率(11.43%)。在孕婦巨細(xì)胞病毒感染研究中[26]，低親和力抗體者在不良孕產(chǎn)史孕婦中所占比例高于初次妊娠孕婦，提示不良孕產(chǎn)史孕婦的胎兒感染巨細(xì)胞病毒風(fēng)險(xiǎn)率高于初次妊娠孕婦組?？贵w親和力試驗(yàn)可高效診斷相關(guān)病原體宮內(nèi)感染，有利于產(chǎn)前診斷和優(yōu)生優(yōu)育，且具有較高的臨床價(jià)值。

3.3 免疫狀態(tài)分析 盡管人群普遍接種風(fēng)疹、麻疹和腮腺炎等疫苗，其相關(guān)的傳染病發(fā)病率得到了有效控制，但仍有少數(shù)病例發(fā)生。當(dāng)疑似病例出現(xiàn)時(shí)，我們不僅需要確認(rèn)是否由相關(guān)病原體引起，還要知道是否經(jīng)免疫接種，或者免疫接種未成功，或免疫接種成功過但免疫力消失?？贵w親和力技術(shù)已被用于免疫接種效果評(píng)價(jià)和免疫狀態(tài)區(qū)分。Souza等[27]在麻疹免疫效果研究中發(fā)現(xiàn)，初次免疫后2～8周抗體以低親和力形式存在，且隨著時(shí)間增長，親和力增加；在90份已接種兩劑疫苗的血標(biāo)本和42份兒童臍血標(biāo)本中未檢出低親和力抗體，證明抗體親和力技術(shù)是評(píng)價(jià)免疫效果較好的工具。Pannuti等[28]以107名無麻疹疫苗免疫史和52名有麻疹疫苗免疫史的患者為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)97.2%無免疫史的患者呈麻疹抗體低親和力結(jié)果，即初次免疫反應(yīng)；48.1%有免疫史患者未檢出IgG抗體或檢出低親和力抗體，即為免疫未成功的原發(fā)免疫失敗，51.9%有免疫史患者檢出高親和力抗體，即為免疫力消失的繼發(fā)免疫失敗?？贵w親和力試驗(yàn)可鑒別受種者的疫苗免疫狀態(tài)，特別是對(duì)那些計(jì)劃免疫工作薄弱地區(qū)或免疫史不明的人群的監(jiān)測(cè)有較大意義。應(yīng)用抗體親和力可指示免疫保護(hù)力下降的特點(diǎn)，可判斷人群是否需要再接種以及何時(shí)再接種。

4 商品化試劑盒的應(yīng)用

在優(yōu)生優(yōu)育檢測(cè)中，已有抗體親和力檢測(cè)的商品化試劑盒。有學(xué)者[29]對(duì)意大利索靈公司和美國羅氏公司的巨細(xì)胞病毒親和力檢測(cè)試劑盒進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)：二者的相對(duì)靈敏度為90.90%，相對(duì)特異度為98.25%，相對(duì)符合率為98.02%，兩種試劑盒的檢測(cè)效果滿意，臨床上應(yīng)用前景較好。目前，仍有許多學(xué)者及機(jī)構(gòu)在研制抗體親和力的檢測(cè)試劑盒。

抗體親和力試驗(yàn)是判斷傳染病原發(fā)感染和非原發(fā)感染的最好方法之一，是對(duì)傳統(tǒng)病原學(xué)及免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的重要補(bǔ)充。近年來，對(duì)該實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷摸索及持續(xù)改進(jìn)，使得其靈敏度和特異度均有所提高，方法更易于應(yīng)用。筆者相信今后會(huì)有越來越多的病原體抗體親和力檢測(cè)試劑盒推向市場。

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藍(lán)翊文(1969～)，女，研究生，主管技師，研究方向：病原微生物檢測(cè)。

R 446.6

A

0253-4304(2016)12-1744-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.12.32

2016-07-30

2016-10-18)