分子免疫遺傳學在輸血醫(yī)學中的應用▲

莫秋紅 申衛(wèi)東 周 燕

(南寧中心血站暨南寧輸血醫(yī)學研究所，南寧市 530007，E-mail：qiuhongmo@126.com)

綜 述

分子免疫遺傳學在輸血醫(yī)學中的應用▲

莫秋紅 申衛(wèi)東 周 燕

(南寧中心血站暨南寧輸血醫(yī)學研究所，南寧市 530007，E-mail：qiuhongmo@126.com)

隨著輸血技術及相關領域突飛猛進的發(fā)展，輸血醫(yī)學已成為臨床醫(yī)學中不可或缺的重要組成部分，這一學科在現(xiàn)代醫(yī)學中備受關注并得到了重新認識?；蚋锩鼤r代的到來，使得輸血醫(yī)學中的配血方式在慢慢發(fā)生改變。本文就以DNA檢測技術為基礎的分子免疫遺傳學在輸血醫(yī)學中的應用進行綜述。

血型；基因檢測；凝集法；輸血醫(yī)學

自從20世紀初ABO血型被發(fā)現(xiàn)后，由國際輸血協(xié)會正式公布的紅細胞血型系統(tǒng)有33個，包括339個抗原，其中297個抗原屬于簇，其他屬于集合[1]。1986年MN血型 GYPA基因成為第一個被克隆的血型基因，隨后對所有編碼血型系統(tǒng)的基因或基因家族(如MNS、Rh和Ch/Rg系統(tǒng))都完成了克隆、測序工作，明確了絕大部分血型抗原相關的分子基礎。除一些罕見突變之外，血型的分子基礎主要是單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism，SNP)。大量血型分子信息，為實現(xiàn)應用DNA檢測技術預測血型的表現(xiàn)型提供了基礎。目前輸血醫(yī)學進入基因革命時代，輸血醫(yī)學中血液的配血方式也將發(fā)生改變[2]。另外，基因技術在檢測D-接合性、非侵入型胎兒血型等方面更顯示出其獨特的優(yōu)勢。本文就以DNA檢測技術為基礎的分子免疫遺傳學在輸血醫(yī)學中的應用進展作一綜述。

1 紅細胞凝集法和DNA檢測技術

1.1 紅細胞凝集法 紅細胞凝集法是檢測血型抗原和抗體的經(jīng)典方法，該技術在輸血醫(yī)學領域里已經(jīng)沿用了幾十年，其特點如下：(1)應用價值：紅細胞凝集法一直作為檢測紅細胞表面血型抗原的“金標準”服務于輸血機構(gòu)，其實驗操作簡單、快速，對設備要求不高，只要操作正確便可獲得具有較高特異性和靈敏性的結(jié)果，基本滿足大部分輸血患者的臨床要求。(2)檢測試劑：抗體試劑從被免疫的患者或獻血者中獲得(多克隆或單克隆)，或從被免疫的小鼠中獲得(單克隆)。但原材料具有生物危害，并且數(shù)量逐漸減少。且經(jīng)批準認證的商品化試劑價格不斷增長，而很多抗體試劑并非經(jīng)商業(yè)化便可買到，通常是來源于實驗室間的交換。此外，某些抗體劑量很少，或者反應較弱。(3)局限性：紅細胞凝集法是一種主觀性檢測，依賴于高特異性的抗體試劑；勞動密集型檢測只能分析少量獻血者的血型，從而限制了稀有血型血液的庫存量；對于胎兒新生兒溶血病(hemolytic disease of fetus and newborn，HDFN)風險只能間接預測和評估；難以確認近期輸血和免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G型直接抗球蛋白試驗陽性(direct antiglobulin test+，DAT+)患者的紅細胞分型；難以區(qū)分同種抗體和自身抗體，影響血型分型；無法識別RhD接合性。

1.2 DNA檢測技術 其特點為：(1)應用優(yōu)勢：可實現(xiàn)自動化；可對一個標本同時檢測多個血型標記物，實現(xiàn)高通量；可通過計數(shù)機的DNA配型來選擇與患者配合的血液。(2)檢測試劑：探針和引物為靶特異性，成本低，可大量生產(chǎn)，方便購買。(3)局限性：該技術只是預測抗原分型，特別是稀有血型，還需用紅細胞凝集法再做確認；實驗過程耗時長；DNA和紅細胞凝集法檢測結(jié)果可能不一致；體細胞和血細胞獲得DNA的結(jié)果可能不一致；多種基因分型可能得到相同的表型，特別是null表型；還存在很多尚未知曉的等位基因。目前基因分型的結(jié)果只作為研究，尚未直接應用于臨床。

2 血型基因分型及其臨床應用

以往血型抗原和相應的特異性都是應用傳統(tǒng)的免疫血清學方法或生物化學方法進行鑒定和研究，從20世紀90年代起，隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，整個血型研究和應用領域很快進入分子水平，研究重點轉(zhuǎn)向血型基因多態(tài)性的分子基礎、組織特異性表達、結(jié)構(gòu)和生物功能，以及在生命學科中的應用。

2.1 大量輸血患者的血型檢測 因疾病而需要長期輸血或大量輸血的患者，其外周血中存在獻血者的紅細胞，使凝集試驗的紅細胞分型既復雜又耗時，而且實驗結(jié)果有可能不準確[3]。DNA檢測技術可以克服這些問題。由于DNA檢測的目標是所有等位基因的基因區(qū)域，即使存在少量獻血者的DNA也會在PCR過程中被患者的DNA競爭抑制，可獲得準確的血型結(jié)果。大量輸注非少白細胞血液的患者也可以通過口腔拭子或尿沉渣提取DNA進行PCR，從而獲得準確分型[4-7]。

2.2 DAT+患者的血型檢測 自身免疫性溶血貧血或者紅細胞表面覆蓋IgG的患者，無法通過間接抗球蛋白試驗完成對紅細胞血型的鑒定。即使利用IgG去除技術，但去除效果往往不佳，并且可能破壞紅細胞抗原，得到錯誤的結(jié)果。此時基因檢測是一個可選擇的可靠方法。

2.3 獻血者血液篩選 血清學是以特異性的抗體試劑為基礎的實驗方法，沒有分型試劑將不能完成血液篩選。為了克服試劑問題，基因分型可以代替血清學為患者篩選合適的血液。對于含有Dombrock、Colton、Kell(Jsa、Kpa)和Diego血型系統(tǒng)抗體的患者[8-11]，利用血清學方法找到合適的血液是非常困難的，因為這些血型對應的抗體雖然有潛在的臨床意義，但是通常為弱反應，僅少數(shù)可在凝集試驗中被檢出，而且產(chǎn)生這些稀有血型抗體的血清中通常存在其他的同種抗體，即患者含有多重抗原的抗體，使得凝集試驗的結(jié)果分析更加復雜[11]。DNA分析則遠遠超越了血清學凝集試驗的血型分型能力。

2.4 RhD接合性檢測 血清學檢測紅細胞表面抗原D、C/c和E/e，只能推測該樣本RhD基因純合子(D/D)或雜合子(D/-)的可能性。而分子生物學通過檢測D陰性者的隱性等位基因，判斷RhD基因的接合性。當母親體內(nèi)存在抗-D抗體，利用父親的RhD基因接合性預測胎兒D血型，這在產(chǎn)前檢查中是非常重要的。由于很多不同的基因事件會產(chǎn)生D陰性的表型[12-13]，所以必須采取多種基因檢測方法來分析不同的基因事件，包括檢測RhD基因缺失、37堿基對插入RhD假基因和D陰性RhD-CE-D雜交基因[14-15]，才能獲得準確的RhD接合性。在產(chǎn)前檢查中，常規(guī)用血清學方法檢測RhD抗原，如果父親是陽性的結(jié)果，需要進一步用DNA技術檢測父親基因的接合性(如純合子或雜合子)。如果父親是純合子基因，其所有的孩子都是陽性，必須進行孕期監(jiān)測。如果父親有一個缺失RhD基因或無效RhD基因，胎兒可能是陰性，或不存在HDFN風險。能否排除胎兒新生兒溶血病風險，還需要通過檢測胎兒血型來確定。

2.5 D抗原減少(weak D)和缺失部分D抗原決定簇(partial D)的鑒別 紅細胞D抗原分型中，可能有2%個體為weak D或partial D變異體，這些變異體是由變異型RhD基因編碼。不同生產(chǎn)廠家抗體試劑的差異及實驗方法的不同(如試管法、固相法、凝膠法或自動分析儀)，與紅細胞反應結(jié)果、D分型可能不一樣。區(qū)分weak D和partial D與育齡婦女、臨床輸血密切相關。一般情況，partial D會產(chǎn)生抗-D抗體，而 weak D不會，所以partial D在輸血治療中應視為D陰性，該分型的婦女或患者也應視為Rh免疫球蛋白治療方案的對象[16]。目前，常規(guī)的血清學檢測試劑不能區(qū)分這兩種分型，但檢測RhD多個區(qū)域的基因分型可鑒別partial D和weak D。

2.6 胎兒血型鑒別 產(chǎn)前檢查中，DNA基因分型對于判斷胎兒是否遺傳了父親的抗原有著重要的作用。如果胎兒相應抗原是陰性，胎兒就不存在發(fā)生HDFN的風險，母親也就不需要接受昂貴的侵入式監(jiān)測和免疫調(diào)節(jié)藥物治療。胎兒的DNA可以從羊水或絨毛樣本中的細胞獲得，也可以在懷孕大約5周后，從母親的血漿中獲得胎兒DNA。從母親外周血的血漿或血清中獲得非細胞的游離胎兒DNA[17]，對非侵入性產(chǎn)前診斷、胎兒性別診斷、父系單基因遺傳病起到突破性的作用[18-21]。母親血漿內(nèi)的胎兒DNA來源于合胞體滋養(yǎng)層細胞的凋亡[22]，隨著胎齡的增長，DNA的濃度也相應增加，但分娩之后就快速被清除[17，19]，因此上一次懷孕產(chǎn)生的游離胎兒DNA不會影響到本次孕期的檢測。定量PCR可以準確檢測母親血漿內(nèi)的胎兒DNA，鑒定胎兒的D血型。

2.7 DNA血型分型用于試劑紅細胞 紅細胞血型基因分型可用于提高抗體鑒定試劑紅細胞的品質(zhì)[23]。通過DNA血型分型可以明確試劑紅細胞的抗原是否“雙倍劑量”，當患者血清中的抗體反應很弱時尤其重要，如S、D、Fya、Fyb、Jka、Jkb；抗血清缺乏或質(zhì)量差不能篩選到合適試劑紅細胞時，可通過基因分型預測抗原來選擇，如Doa/Dob、Coa/Cob。只有品質(zhì)好的抗體篩查或抗體鑒定的試劑紅細胞，才能保證臨床上有意義的抗體不被漏檢。

2.8 減少同種免疫風險，優(yōu)化庫存管理 據(jù)有關統(tǒng)計分析，約13%的輸血患者存在產(chǎn)生同種抗體的風險，多次輸血的鐮狀紅細胞貧血患者和已產(chǎn)生某種抗體的患者，更是增加了產(chǎn)生另外抗體的風險[24-25]。分子基因分型在輸血醫(yī)學中的應用，可對獻血者進行多個血型位點的檢測，通過電腦系統(tǒng)選擇多血型抗原配合的血液給予患者，而這是一種具有重要意義的改變。多血型抗原配合的輸血可以降低同種免疫，有利于提高醫(yī)療護理和輸血效果。339個抗原都能完全配合只是理想狀態(tài)，在實際的臨床輸血工作中，也沒必要如此謹慎，因為并不是所有血型系統(tǒng)都具有臨床意義，另外有限的庫存也限制了每個患者所輸注的紅細胞血型配合程度。首先實現(xiàn)5個主要的抗原系統(tǒng)的配合，包括Rh(Cc、Ee)、Kell、Kidd(Jka/b)、Duffy(Fya/b)和Ss，其發(fā)生同種免疫的風險很高，而輸血患者能接受更多血型配合的血液是更佳的選擇。隨著基因技術的發(fā)展，血液庫存管理系統(tǒng)的完善，招募工作更集中于少數(shù)稀有血型的獻血者，庫存管理得以優(yōu)化，患者可獲得更多血型抗原配合的輸血，可避免同種免疫。

3 DNA檢測技術應用中的問題

DNA分析不是常規(guī)鑒定獻血者ABO和RhD的選擇方法。原因如下：凝集試驗進行ABO正反定型時，天然的抗-A、抗-B提供了對照試驗；采用高效標準的單抗進行ABO和RhD分型相對簡單快速；目前輸血前檢測體系適合凝集試驗。另外，D抗原弱表達的紅細胞幾乎都是C+或E+，一部分弱D患者通過輸注D、C、E抗原陰性紅細胞而獲得安全治療。因此，對于常規(guī)ABO和D檢測來說，DNA檢測更耗時、更復雜，且并未提高凝集試驗的輸血治療效果。再者，某些突變導致A或B轉(zhuǎn)移酶無活性而形成O型，如果標本中存在一個未知的無活性等位基因而產(chǎn)生ABO血型錯誤的風險，這樣的風險在選擇血液輸血中是不能接受的。SNP分型只是預測表現(xiàn)型，有時不能準確反映紅細胞表型。如基因表達抑制或基因無活性表達，以及尚未知曉的多態(tài)性，都可能得到假陽性。在臨床輸血前進行檢測，如果患者發(fā)生同種免疫，產(chǎn)生臨床有意義的抗體，DNA基因分型就不能代替抗體篩查和抗體鑒定。時間也是一個必須考慮的問題，從樣本的DNA提取到數(shù)據(jù)結(jié)果，目前多重PCR系統(tǒng)為7個小時，即使檢測時間可能在將來縮短，對于緊急輸血的患者，也不適宜使用多個血型抗原配合的輸血模式。

4 總 結(jié)

將分子技術應用于臨床需要多領域的技術和知識，例如分子技術、基因結(jié)構(gòu)和方法、血型分子基礎、血液凝集技術、血型抗原表達、可影響基因分型的因素(如嵌合體)以及相關管理條例等，同時需要將DNA和血清學的結(jié)果進行綜合分析，從而為臨床解決問題。血清學凝集試驗存在著某些缺陷，PCR檢測技術作為輔助手段將成為一種強大工具，特別在D-接合性、非侵入性胎兒血型鑒定、鐮狀細胞性貧血患者配血上，比血清學更勝一籌。雖然目前分子生物學應用于輸血行業(yè)僅限于血型參比實驗室，隨著高通量平臺的建立和發(fā)展，基因檢測將成為輸血行業(yè)的主流，其可能從根本上改變輸血前檢測的程序，通過多個血型位點選擇與患者抗原相匹配的血液，避免潛在的同種免疫，可明顯的提高輸血治療效果。

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廣西自然科學基金(2010GXNSFA013262)；廣西衛(wèi)生廳自籌課題(Z2010196)；廣西南寧市科學研究與技術開發(fā)計劃(201003048C-1)

莫秋紅(1979～)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：輸血醫(yī)學免疫學及分子生物學研究。

R 457.1

A

0253-4304(2016)01-0095-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.01.29

2015-08-01

2015-10-20)