微小RNA治療學(xué)及其在冠心病中的應(yīng)用研究進(jìn)展

梁寶今 梁 濤 周卓東 蒙如慶

(1 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，百色市 533000，E-mail：liangbaoj@126.com；河池市人民醫(yī)院2 心血管內(nèi)科，3 腎內(nèi)科，河池市 547000)

微小RNA治療學(xué)及其在冠心病中的應(yīng)用研究進(jìn)展

梁寶今1梁 濤2周卓東2蒙如慶3

(1 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，百色市 533000，E-mail：liangbaoj@126.com；河池市人民醫(yī)院2 心血管內(nèi)科，3 腎內(nèi)科，河池市 547000)

人類基因組90%以上是由非編碼RNA組成的，而微小RNA(miRNA)是一類可調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)與靶基因3′UTR結(jié)合，調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)錄后水平，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、胚胎發(fā)育、血管形成等病理生理過(guò)程。隨著miRNA在冠心病的作用不斷被闡明，促進(jìn)了miRNA治療學(xué)的發(fā)展，包括miRNAs拮抗劑、miRNA海綿、反義寡核苷酸等。本文就近年來(lái)針對(duì)miRNA治療學(xué)及其在冠心病領(lǐng)域的應(yīng)用研究作一綜述。

微小RNA；冠心病；治療；綜述

冠心病(coronary heart disease，CHD)是目前最常見(jiàn)的心血管疾病之一，是危害人類健康和導(dǎo)致死亡的主要疾病。目前，CHD的主要治療方法有藥物治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等方法。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類大約由18～23個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，與蛋白質(zhì)編碼基因3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[1]。是CHD發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。miRNA的發(fā)展促進(jìn)了miRNA治療學(xué)的發(fā)展，包括miRNAs拮抗劑、miRNA海綿、反義寡核苷酸等。近年來(lái)隨著生命遺傳學(xué)飛速發(fā)展，其也逐步應(yīng)用于心血管疾病。現(xiàn)就基于miRNA治療學(xué)及其在CHD中的應(yīng)用綜述如下。

1 miRNA的生物學(xué)特性及其與CHD的關(guān)系

心血管疾病是全球死亡的重要原因，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病具有較高的死亡率，臨床上需要一種新的診斷方法和治療策略以降低發(fā)病率。隨著miRNA在CHD中的調(diào)控作用逐漸闡明，以miRNA為基礎(chǔ)的治療方式成為重要研究?jī)?nèi)容。miRNA在形成過(guò)程中經(jīng)歷3種形式：初級(jí)miRNA、前體miRNA、成熟的miRNA。數(shù)以千計(jì)的人類蛋白質(zhì)基因通過(guò)miRNA調(diào)節(jié)表達(dá)，尤其在血細(xì)胞生成期間，miRNA是一類重要的負(fù)性調(diào)節(jié)劑[2-3]。miRNA通過(guò)與mRNA靶基因的3′-UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，抑制靶mRNA的翻譯，進(jìn)而參與血細(xì)胞的發(fā)育、分化、凋亡，以及激素分泌和某些生物過(guò)程，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)。最新的研究表明，許多miRNA參與血小板相關(guān)基因的表達(dá)[4-5]。miRNA已被證實(shí)參與急性冠狀動(dòng)脈綜合征發(fā)病機(jī)制，包括動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂、血小板激活和聚集以及冠狀動(dòng)脈閉塞后心肌細(xì)胞的死亡[6-8]。大量的miRNA以組織特異性方式表達(dá)，并且可進(jìn)入到血漿和尿液中[7，9]。特定的miRNA參與動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮功能障礙引發(fā)的斑塊破裂階段，是CHD早期診斷和治療靶標(biāo)的潛在生物標(biāo)志物。在急性心肌細(xì)胞梗死的動(dòng)物模型及ST段抬高性心肌梗死(STEMI)患者中，miRNA-1、miRNA-133A、miRNA-208、miRNA-208b、miRNA-499以及miRNA-499-5P有顯著變化，并且認(rèn)為可作為心肌損傷的潛在生物標(biāo)志物[10]。miRNA-126具有調(diào)控黏附分子表達(dá)及血管炎癥反應(yīng)功能，在CHD中對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過(guò)程起保護(hù)作用[11]。

2 miRNA生物學(xué)療法

2.1 miRNA拮抗劑 miRNA拮抗劑是單鏈RNA分子，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)方式與miRNA結(jié)合，是寡核苷酸特異性沉默單個(gè)內(nèi)源性miRNA的一類化學(xué)制劑。對(duì)miRNA拮抗劑進(jìn)行化學(xué)修飾，可使其具有抗核酸酶的作用并利于細(xì)胞吸收。miRNA的組織特異性和靶向性的特點(diǎn)使靶標(biāo)研究有治療價(jià)值，可以通過(guò)miRNA拮抗劑來(lái)抑制miRNA[12]。成熟的miRNA與Argonaute2蛋白等結(jié)合，構(gòu)成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到成熟的靶miRNA[12]，導(dǎo)致RISC的激活減少，從而調(diào)節(jié)特定的mRNA水平和基因表達(dá)水平[13]。利用化學(xué)穩(wěn)定的互補(bǔ)寡核苷酸或者其活性模擬物可以抑制miRNA?？?miRNA不可逆地結(jié)合于互補(bǔ)的靶miRNA序列，miRISC復(fù)合物阻斷加工過(guò)程，但該機(jī)制還沒(méi)有得到充分的證實(shí)。把抗miRNA基因編碼末端的2-0-甲基與膽固醇連接起來(lái)，可以產(chǎn)生RNA拮抗劑?？?miRNA和miRNA拮抗劑大多作用于嚙齒動(dòng)物中，只有少部分研究采用靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型。其中，有研究表明，miRNA-33抑制劑在靈長(zhǎng)類動(dòng)物非洲綠猴身上通過(guò)上調(diào)肝臟三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1編碼基因水平從而上調(diào)高密度脂蛋白水平來(lái)抵抗miRNA[14]。miRNA拮抗劑對(duì)血脂異常的治療是有效的，但是也面臨著有關(guān)特異性和靶向遞送的挑戰(zhàn)。

2.2 miRNA海綿 減少miRNA的量和降低miRNA效果的另一種方式是miRNA海綿。miRNA海綿是一種miRNA靶基因的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，是將若干個(gè)miRNA的反義序列串聯(lián)在一起，連接到合適的載體中表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄物“吸附”相應(yīng)的miRNA，與miRNA靶基因形成競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致靶基因去抑制化。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑通過(guò)作用于miRNA家族結(jié)合位點(diǎn)，阻斷miRNA活性[15]。這樣抑制劑可以暫時(shí)從轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒中表達(dá)或穩(wěn)定地插入染色體中。通過(guò)將miRNA海綿與完整或不完整的互補(bǔ)miRNA結(jié)合，使受影響的miRNA不能與原來(lái)的mRNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而降低mRNA和基因表達(dá)的效果[12]。相對(duì)于拮抗劑，miRNA海綿僅僅特定于一個(gè)miRNA的種子區(qū)，因此能夠阻斷miRNA家族。將編碼miRNA結(jié)合位點(diǎn)的序列整合人宿主細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)海綿轉(zhuǎn)錄物持續(xù)、穩(wěn)定、高效、安全地表達(dá)。miRNA海綿可抑制具有相同種子序列的miRNA，這對(duì)基因敲除是有利的，但抑制目標(biāo)miRNA時(shí)可能也會(huì)對(duì)其他miRNA產(chǎn)生影響。

2.3 miRNA反義核酸技術(shù) 反義核酸技術(shù)通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)靶序列的反義核酸，特異性抑制靶基因的表達(dá)。一種反義抑制劑只針對(duì)一種miRNA，要抑制整個(gè)miRNA家族，需要有多種反義寡核苷酸(anti-sense oligonucleotides，ASOs)混合物。寡核苷酸通常有15～23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，2′甲氧基插入核糖體環(huán)中進(jìn)行化學(xué)修飾，以增加它們的穩(wěn)定性和減少DNA酶的易感性。ASOs對(duì)于單一蛋白減少的治療是有益的。ASOs是具有高度特異性的單個(gè)基因單鏈互補(bǔ)序列，通過(guò)酶H裂解轉(zhuǎn)錄物中斷mRNA的翻譯。這可以防止靶mRNA被翻譯，減少蛋白質(zhì)的表達(dá)。ASOs可通過(guò)靜脈內(nèi)輸注或皮下注射轉(zhuǎn)運(yùn)至腎、肝、脾、脂肪細(xì)胞和骨髓，但不能通過(guò)血腦屏障[16]。miRNA同時(shí)針對(duì)多個(gè)mRNA抑制相似或相同途徑的基因，從而改變生物網(wǎng)絡(luò)[16]。在疾病狀態(tài)下，miRNA的異常調(diào)節(jié)能夠改變基因網(wǎng)絡(luò)，miRNA的替代療法或反義抑制作用可以使細(xì)胞基因表達(dá)恢復(fù)到正常狀態(tài)[16]。

3 miRNA治療與CHD

3.1 miRNA治療與心肌梗死 Ren等[17]發(fā)現(xiàn)miRNA-320的抑制作用是通過(guò)使用miRNA-320拮抗劑導(dǎo)致梗死面積顯著減少；體外誘導(dǎo)的心肌梗死大鼠模型表明miR-320基因沉默可以減少細(xì)胞的死亡和凋亡。Ye等[18]發(fā)現(xiàn)通過(guò)在缺血再灌注模型小鼠中使用miRNA-29反義抑制劑，能夠保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷。β2腎上腺受體拮抗劑抑制心肌梗死后心肌細(xì)胞鈣超載，在體內(nèi)抗-miRNA對(duì)miRNA-let-7的抑制作用促進(jìn)了β2腎上腺受體的表達(dá)，使在心血管疾病患者中使用腎上腺素拮抗劑更加復(fù)雜化。長(zhǎng)期使用miRNA治療劑的副作用可以通過(guò)特定組織miRNA調(diào)節(jié)來(lái)緩解，如通過(guò)靶向遞送miRNA治療劑或者特異性表達(dá)的受限組織miRNA，以及生化過(guò)程中特異性調(diào)節(jié)的miRNA。Quiat等[19]發(fā)現(xiàn)miRNA-29治療劑靶向治療心肌梗死、減少瘢痕形成時(shí)，可能會(huì)損傷主動(dòng)脈血管的完整性，通過(guò)遞送miRNA-29模擬物及使用藥物洗脫冠脈支架，可以防止這種不良后果。

3.2 miRNA治療與高脂血癥 他汀類降脂藥可有效地降低低密度脂蛋白(LDL)水平，但部分患者服用他汀類藥物后會(huì)出現(xiàn)肌痛等副作用，甚至出現(xiàn)他汀抵抗現(xiàn)象。使用miRNA治療方法能有效降脂，并且副作用較少。miRNA-122和miRNA-33a/b的慢性抑制作用分別有助于改變血脂水平并減少副作用。載脂蛋白B是LDL顆粒及相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化脂蛋白的重要組成部分，ASOs靶向作用于載脂蛋白B。米泊美生鈉注射劑目前已被批準(zhǔn)用于治療家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia，F(xiàn)H)及脂代謝遺傳性疾病[20-22]。Kynamro主要在肝臟積累，使載脂蛋白B的mRNA沉默，從而降低載脂蛋白B和LDL的劑量和時(shí)間依賴性。在FH患者中，Kynamro治療使LDL水平降低25%～50%，降脂效果明顯。長(zhǎng)期使用Kynamro等藥物的副作用包括注射部位反應(yīng)、肝毒性和肝脂肪變性。在血脂異常、胰島素抵抗和代謝綜合征患者中發(fā)現(xiàn)載脂蛋白CⅢ水平升高，而載脂蛋白CⅢ是極低密度脂蛋白的組成部分，ASOs可靶向作用于載脂蛋白CⅢ，抑制脂蛋白、肝脂肪酶，降低肝臟對(duì)甘油三酯的攝取，可用于高甘油三酯血癥的治療。

3.3 miRNA治療與動(dòng)脈粥樣硬化 動(dòng)脈粥樣硬化是慢性炎性疾病，可引起威脅性命的并發(fā)癥如心肌梗死和卒中，其往往始于內(nèi)皮功能障礙，后期脂肪酸化合物、膽固醇、鈣及其他物質(zhì)逐漸在動(dòng)脈內(nèi)積累，最終形成斑塊。miRNA-33a內(nèi)含子位于人類固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2上，可控制膽固醇的吸收與合成[14]。miRNA-33拮抗劑通過(guò)20F/MOE修飾基因沉默治療，使高密度脂蛋白水平升高，血漿極低密度脂蛋白水平降低，甘油三酯水平降低[23]。miRNA及其關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶Dicer酶在內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)揮主要功能。敲除Dicer酶誘導(dǎo)的miRNA(let-7、miRNA-21、miRNA-126、miRNA-221、miRNA-222)可導(dǎo)致受損的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，炎性趨化因子和細(xì)胞因子增多[24]。不同的miRNA在斑塊的進(jìn)程中有不同的作用，miRNA的失調(diào)對(duì)斑塊不穩(wěn)定、破裂起著重要作用[25-26]。內(nèi)皮細(xì)胞特異性miRNA-126獨(dú)特的腺病毒載體(adenoviral，Ad)編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白 p27kipl(p27)并與成熟miRNA-126-3p鏈互補(bǔ)的靶序列末端結(jié)合(Ad-p27-126TS)。Ad-p27-126TS轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)脈球囊損傷模型外源性P27過(guò)度表達(dá)，證實(shí)了Ad-p27-126TS具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞增殖功能[27]。Santulli等[27]發(fā)現(xiàn)Ad-P27-126TS治療的動(dòng)物在治療2～4周后再狹窄水平降低，出現(xiàn)完整再內(nèi)皮化，表明以miRNA為基礎(chǔ)的方式可以抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，從而防止再狹窄，也可以選擇性地促進(jìn)內(nèi)皮恢復(fù)和保護(hù)內(nèi)皮功能。Bonauer等[28]發(fā)現(xiàn)心肌梗死模型小鼠在全身應(yīng)用針對(duì)miRNA-92a的微小RNA拮抗劑后，血管生長(zhǎng)增強(qiáng)，受損的組織得到恢復(fù)，表明抗-miRNA-92a拮抗劑可誘導(dǎo)抗動(dòng)脈粥樣硬化的效果及阻斷內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

4 小 結(jié)

miRNA作為調(diào)控因子為預(yù)防和治療CHD提供了新的作用靶點(diǎn)，其治療方法的研究有助于在分子水平上預(yù)防和治療CHD。然而，目前基于miRNA功能的治療方法如miRNA海綿和miRNAs拮抗劑在心血管領(lǐng)域中還未直接應(yīng)用于臨床，仍面臨許多挑戰(zhàn)，如藥物器官靶向性及潛在的毒副作用等。但是隨著基因技術(shù)研究的逐漸深入，靶向miRNA的藥物在該領(lǐng)域?qū)⒂懈鼜V闊的臨床前景。

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梁寶今(1988～)，女，在讀碩士研究生，研究方向：冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的防治。

梁濤(1965～)，男，碩士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的防治，E-mail：liangtao655188@163.com。

R 541.4

A

0253-4304(2016)02-0243-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.28

2015-09-08

2015-12-21)