基因疫苗黏膜免疫及其機(jī)制的研究進(jìn)展

秦妍 管曉燕,2 綜述 白國(guó)輝,2 劉建國(guó),2 審校

(1.遵義醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.貴州省高等高?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室遵義市口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

基因疫苗黏膜免疫及其機(jī)制的研究進(jìn)展

秦妍1管曉燕1,2綜述 白國(guó)輝1,2劉建國(guó)1,2審校

(1.遵義醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.貴州省高等高?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室遵義市口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

基因疫苗； 黏膜免疫； 分泌型免疫球蛋白； 免疫佐劑

基因疫苗是將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達(dá)系統(tǒng)的載體質(zhì)粒上，然后將重組質(zhì)粒直接導(dǎo)入人或動(dòng)物體內(nèi)，讓其在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。以達(dá)到預(yù)防疾病的目的?，F(xiàn)已證實(shí)基因疫苗的有效性及安全性，但存在人體不能對(duì)基因疫苗進(jìn)行有效的吸收以及機(jī)體對(duì)抗原的免疫耐受等不足，使其在人體中的免疫效果不佳。近年來(lái)，對(duì)基因疫苗的免疫策略、免疫效果及作用機(jī)制已進(jìn)行了大量的研究。肌肉注射法因外源基因在體內(nèi)的表達(dá)水平較低，免疫效果不夠理想?；驑尫?、電穿孔等遞送技術(shù)的發(fā)展均顯著提高了基因疫苗的活體遞送效率，使基因疫苗免疫具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力[1-2]。

口服、鼻腔黏膜滴注等黏膜免疫途徑因其給藥安全方便，價(jià)錢(qián)便宜，安全等優(yōu)點(diǎn)[3]已受到廣泛關(guān)注?；蛞呙绲酿つっ庖咄緩讲煌?，所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答強(qiáng)弱也不同。本文就基因疫苗的黏膜免疫的效果及其機(jī)制研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 基因疫苗的黏膜免疫

黏膜免疫系統(tǒng)(MIS)是指廣泛分布于呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺體(唾液腺、淚腺、乳腺)處的淋巴組織，這些淋巴組織提供了天然的保護(hù)，防止病原體從機(jī)體表面進(jìn)入，減少病原體散布到黏膜下組織、局部淋巴結(jié)、血液中。因此，黏膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗病原體入侵的第一道免疫屏障，同時(shí)，黏膜免疫系統(tǒng)也是免疫系統(tǒng)中最大的部分，是執(zhí)行局部特異性免疫功能的主要場(chǎng)所。

近年關(guān)于黏膜免疫的前沿研究提示,誘導(dǎo)黏膜局部免疫應(yīng)答,將比常規(guī)的全身免疫更有助于清除黏膜感染病原體,預(yù)防感染的擴(kuò)散和慢性化[4]。因此，基因疫苗研究的熱點(diǎn)主要在黏膜免疫?；蛞呙绲酿つっ庖咭话闶菍⒒蛞呙缤ㄟ^(guò)表面涂布或基因槍介導(dǎo)等方法進(jìn)行免疫。致敏的淋巴細(xì)胞通過(guò)淋巴細(xì)胞歸巢，大約80%淋巴細(xì)胞再次返回到致敏的黏膜部位發(fā)揮免疫功能，即存在局部黏膜免疫反應(yīng)[5]。另外，大約20%的淋巴細(xì)胞會(huì)進(jìn)入其它黏膜部位參與其效應(yīng)反應(yīng)，稱(chēng)共同黏膜免疫系統(tǒng)(CMIS)[6]。

基因疫苗接種后還可以誘導(dǎo)長(zhǎng)期的免疫記憶[7]，許慶安等[8]在靶向防齲基因疫苗pGJA-P/VAX經(jīng)鼻黏膜滴注途徑免疫BALB/c小鼠的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，基因疫苗可在免疫原位和引流淋巴結(jié)存在6個(gè)月。

1.1 鼻腔滴注免疫 人類(lèi)鼻黏膜免疫組織為韋氏環(huán)。鼻內(nèi)pH值為6.5～7.0，鼻黏膜有很高的不規(guī)則度，其表面上皮細(xì)胞的微絨毛，提供了很大的膜面積，能提高鼻黏膜的吸收效率。且鼻腔中酶的活性和種類(lèi)小于胃腸道，相較口服而言，基因疫苗不易受到酶的降解。據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道,與口服免疫相比，抗原經(jīng)鼻黏膜免疫的劑量為口服免疫劑量的四分之一，即鼻黏膜誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原量低于口服免疫[10]，因此鼻黏膜免疫仍是研究的熱點(diǎn)?；蛞呙缤ㄟ^(guò)鼻腔滴注的方式免疫不僅能有效的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)免疫和局部黏膜免疫反應(yīng)[11]，同時(shí)，在鼻黏膜免疫中，由于抗原特異性淋巴細(xì)胞分布在機(jī)體共同黏膜免疫體系中，故可誘導(dǎo)產(chǎn)生共同黏膜免疫反應(yīng)[12]。受抗原刺激后鼻黏膜免疫反應(yīng)過(guò)程大致如下：鼻黏膜在抗原的刺激下，會(huì)啟動(dòng)局部免疫調(diào)節(jié)，IgA沿上皮層彌散定居于黏膜下層各位點(diǎn)。同時(shí)，IgA陽(yáng)性B細(xì)胞在抗原刺激下迅速由黏膜下淋巴管進(jìn)入血液循環(huán)，受Th-2的調(diào)節(jié)，發(fā)育分化增殖后，移動(dòng)到黏膜固有層(LP)中成為成熟IgA漿細(xì)胞和分泌型IgA漿細(xì)胞。繼而與上皮細(xì)胞表面上具有抗菌性能的分泌片段(SC)結(jié)合成為分泌型IgA(SIgA)，SC保護(hù)SIgA不被蛋白水解酶降解。隨后SIgA經(jīng)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至上皮表面，并分泌到外分泌液中，與上皮細(xì)胞緊密結(jié)合，分布在黏膜表面發(fā)揮效應(yīng)[13]，成為特異性免疫球蛋白抵抗外界抗原的第一道防線，其中除SIgA通過(guò)阻止黏附、溶解細(xì)菌、中和病毒、介導(dǎo)ADCC等機(jī)制從而為黏膜表面提供一個(gè)免疫屏障外，還可作為黏膜免疫疫苗的攜帶者，提供安全穩(wěn)定的疫苗傳遞系統(tǒng)[14]。

SIgA是機(jī)體內(nèi)分泌量最多的免疫球蛋白[15]，占黏膜相關(guān)組織產(chǎn)生的所有抗體的80%。而一般DNA疫苗經(jīng)肌肉注射、皮內(nèi)注射等途徑接種, 能產(chǎn)生高滴度的特異性IgG，但I(xiàn)gA水平較低。為更有效抵抗外界刺激，誘導(dǎo)SIgA成為最重要的途徑[16]。

盡管鼻黏膜免疫有很多優(yōu)勢(shì)，但是由于疫苗在鼻腔內(nèi)的低滲透性和短暫的停留時(shí)間，使基因疫苗不能很好的起到免疫作用。最新研究結(jié)果表明：通過(guò)殼聚糖包裹基因疫苗可以在黏膜免疫中顯著的提高特異性SIgA的富集[17]從而更好的發(fā)揮免疫效應(yīng)，也可以通過(guò)微粒系統(tǒng)包裹基因疫苗或表面吸附使被吸附的基因疫苗經(jīng)鼻黏膜免疫后產(chǎn)生明顯高于裸DNA的鼻黏膜免疫應(yīng)答水平。相較于口服免疫，鼻腔免疫因避免了胃腸道酸性環(huán)境及酶對(duì)抗原的破壞、操作簡(jiǎn)便易行而被廣泛采用。

1.2 口服免疫 基因疫苗也可以通過(guò)口服的方式進(jìn)入機(jī)體發(fā)揮免疫應(yīng)答，口服疫苗簡(jiǎn)單易行，是最重要的免疫方式之一。M細(xì)胞是腸道黏膜免疫組織的功能性入口[18]，它是腸黏膜的誘導(dǎo)部位派伊爾集合淋巴結(jié)(PP)中的一種上皮細(xì)胞。PP結(jié)含有大量的免疫細(xì)胞，其中B細(xì)胞主要分布在淋巴濾泡，T細(xì)胞主要位于淋巴間區(qū)，同時(shí)也是黏膜免疫的主要誘導(dǎo)部位。有研究[19]證實(shí)M細(xì)胞的發(fā)展在腸內(nèi)是依靠B淋巴細(xì)胞發(fā)揮其抗原提呈的作用。Neutra等[20]研究發(fā)現(xiàn)M細(xì)胞是大分子顆?？乖M(jìn)入上皮淋巴組織的主要途徑，它能特異性結(jié)合腸道大分子物質(zhì)及微生物并通過(guò)受體介導(dǎo)包吞的方式將抗原轉(zhuǎn)運(yùn)給黏膜下方的淋巴組織，然后抗原提呈細(xì)胞加以處理后呈遞給T淋巴細(xì)胞，同時(shí)通過(guò)促進(jìn)Tfh細(xì)胞的分化能有效提高B淋巴細(xì)胞的活化[21]，B淋巴細(xì)胞分化增強(qiáng)，產(chǎn)生大量SIgA，再與B細(xì)胞合成IgA二聚體，穿過(guò)上皮細(xì)胞進(jìn)入腸腔，啟動(dòng)抗原誘導(dǎo)SIgA特異性黏膜免疫應(yīng)答后與IgG一起發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[22]，隨后通過(guò)胸導(dǎo)管進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而到達(dá)各效應(yīng)部位發(fā)揮免疫效應(yīng)。因此，M細(xì)胞被稱(chēng)為開(kāi)啟黏膜免疫的門(mén)戶(hù)[18]。

此外，成功的黏膜免疫接種是依靠于將抗原提呈到黏膜免疫誘導(dǎo)位點(diǎn)。APC對(duì)激活免疫應(yīng)答起關(guān)鍵性作用。因此，最新研究[23]證實(shí)通過(guò)生物的配體選擇設(shè)備人工培養(yǎng)的M細(xì)胞可以作為遞送靶抗原進(jìn)入黏膜免疫系統(tǒng)的一種佐劑來(lái)增強(qiáng)免疫誘導(dǎo)。但在胃腸道中，胃酸的水解以及各種酶對(duì)基因疫苗的降解可能使基因疫苗過(guò)早失活，在機(jī)體中不能完全發(fā)揮免疫效應(yīng)。有研究[24]報(bào)道,明膠對(duì)溫度穩(wěn)定，可凍干，安全而無(wú)副作用，作為基因疫苗的佐劑不僅增強(qiáng)免疫應(yīng)答，而且明膠可上調(diào)IgA應(yīng)答。微粒系統(tǒng)中除了脂質(zhì)體包裹的基因疫苗的免疫原性得到明顯提高，殼聚糖也作為重要的免疫佐劑可以提高抗體水平，增強(qiáng)免疫應(yīng)答[25]。

1.3 肺部免疫 鼻黏膜免疫可以引發(fā)上呼吸道黏膜免疫，但很難誘導(dǎo)下呼吸道的黏膜免疫，通過(guò)肺部免疫可以有效抵抗下呼吸道感染。人體無(wú)固定的呼吸道相關(guān)淋巴組織的結(jié)構(gòu)，但是抗原或者感染狀態(tài)能夠誘導(dǎo)呼吸道相關(guān)淋巴組織的形成。肺黏膜薄且血管豐富, 吸收面積達(dá)75 m2。在肺黏膜免疫中，基因疫苗顯著增強(qiáng)了肺黏膜局部特異性CD4+Th1細(xì)胞并誘導(dǎo)SIgA抗體的分泌[26]。水平游離的APC隨時(shí)可以抵抗外來(lái)感染，是肺部基因免疫的靶部位，其中肺部上皮細(xì)胞具有抗原遞呈的作用[27]。增強(qiáng)系統(tǒng)在黏膜誘導(dǎo)部位的停滯時(shí)間，可以增加DNA疫苗進(jìn)入黏膜免疫組織的效率, 增強(qiáng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的效應(yīng)。但免疫實(shí)施不便在呼吸道中，因此相較鼻滴及口服臨床應(yīng)用較少。

2 小 結(jié)

基因疫苗通過(guò)黏膜免疫的方式誘發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，不僅是因?yàn)轲つっ庖呓o藥方便、安全等特點(diǎn)，而且基因疫苗進(jìn)入黏膜啟動(dòng)的黏膜免疫應(yīng)答比全身免疫更易清除黏膜上的病原體、預(yù)防機(jī)體感染擴(kuò)散、增強(qiáng)機(jī)體抵抗力[28]。因此選擇通過(guò)不同的黏膜免疫方式進(jìn)入機(jī)體，啟動(dòng)黏膜免疫應(yīng)答，但為讓基因疫苗更完整的到達(dá)黏膜上發(fā)揮其高效性，需借助佐劑作為載體包裹基因疫苗，使其更完整、安全的到達(dá)黏膜表面發(fā)揮黏膜免疫效應(yīng)。但是在黏膜免疫機(jī)制中還存在許多問(wèn)題，如SIgA的高效性是由于其分子的多聚體結(jié)構(gòu)還是SC上額外的抗原決定簇，M細(xì)胞對(duì)病原體的轉(zhuǎn)運(yùn)是特異性或非特異性仍然存在爭(zhēng)論，M細(xì)胞攝取抗原的機(jī)制等都尚未明確。

有關(guān)肺部免疫的相關(guān)機(jī)制的文章并不多。若要使基因疫苗更好更快更安全的進(jìn)入機(jī)體通過(guò)黏膜免疫發(fā)揮其效應(yīng)，這些問(wèn)題必須得到解決，也有待進(jìn)一步研究。

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