誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在皮膚病研究的應(yīng)用進(jìn)展

吳瑾 楊春生 周武軍

·綜述·

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在皮膚病研究的應(yīng)用進(jìn)展

吳瑾 楊春生 周武軍

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是將一系列轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入動(dòng)物或人多種分化成熟的體細(xì)胞，經(jīng)過重組的程序誘導(dǎo)獲得多能干細(xì)胞，其在形態(tài)、增殖能力、表面抗原、基因和蛋白表達(dá)、分化能力等方面與胚胎干細(xì)胞相似，因此，科研工作者利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞代替胚胎干細(xì)胞來研究皮膚病。因誘導(dǎo)多能干細(xì)胞除具有多能性還具有無限增殖的能力，這些特性能使研究者獲得無限的特定細(xì)胞，進(jìn)而建立遺傳性皮膚病模型。將致病的突變基因在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞水平矯正，矯正后的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能產(chǎn)生基因正常的健康皮膚組織細(xì)胞，從而可望治療遺傳性皮膚病。

皮膚疾??；誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；遺傳；基因；治療應(yīng)用

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）最初是2006年日本科學(xué)家Yamanaka等把八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（Oct4）、性別決定區(qū)盒子2、髓細(xì)胞瘤病病毒癌基因同系物、Kruppel樣因子4轉(zhuǎn)錄因子基因克隆入病毒載體，引入小鼠成纖維細(xì)胞使其重編程，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的iPS細(xì)胞在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細(xì)胞相似［1］。后來一系列研究還發(fā)現(xiàn)，除上述4種病毒整合載體外，Nanog和Lin28的病毒整合載體，以及Oct4，性別決定區(qū)盒子2，Kruppel樣因子4和髓細(xì)胞瘤病病毒癌基因同系物的非整合病毒載體或質(zhì)粒載體分別在小鼠和人多種分化細(xì)胞中成功誘導(dǎo)出iPS細(xì)胞。鼠和人的iPS細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、分子標(biāo)記和分化發(fā)育特點(diǎn)等方面與胚囊來源的胚胎干細(xì)胞有著相似的特征［2-3］。

作者單位：223002江蘇省淮安市第二人民醫(yī)院皮膚性病科

1 皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞

獲得iPS細(xì)胞最常見方式是通過小塊皮膚組織的成纖維細(xì)胞（包括小鼠和人皮膚組織）經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子重組誘導(dǎo)獲得。

2008 年，Lowry 等［4］報(bào)道了由患者個(gè)體組織培養(yǎng)獲得的真皮成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)得到患者特定的iPS細(xì)胞。2011 年，Huang等［5］發(fā)現(xiàn)，通過腺病毒介導(dǎo)的過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子過表達(dá)，可以是皮下脂肪細(xì)胞僅在Oct4/性別決定區(qū)盒子2/Kruppel樣因子4誘導(dǎo)下獲得iPS細(xì)胞，這減少了由髓細(xì)胞瘤病毒癌基因同系物引起的致癌風(fēng)險(xiǎn)。同年，Tsai等［6］發(fā)現(xiàn)，人毛乳頭細(xì)胞幾乎表達(dá)除了Oct4之外的所有重組因子，通過應(yīng)用Oct4單種干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（Oct4）可將人毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞，這在一定程度上減少了基因過表達(dá)引起突變的危險(xiǎn)及危害。2015年，Hung等［7］通過簡單的非創(chuàng)傷性方法（拔取頭發(fā)）培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞應(yīng)用非整合型附著體載體誘導(dǎo)得到iPS細(xì)胞。由此可見，皮膚細(xì)胞尤其是拔發(fā)獲得的毛乳頭細(xì)胞及皮下脂肪細(xì)胞，是獲得iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)優(yōu)勢細(xì)胞，不僅取材方便，而且可以避免在成熟體細(xì)胞誘導(dǎo)過程中過多的表達(dá)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，減少癌變的可能，有利于臨床進(jìn)一步應(yīng)用。

2 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化產(chǎn)生皮膚細(xì)胞

目前，已有研究者通過應(yīng)用維A酸和成骨蛋白4改變iPS細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境，將其定向分化為角質(zhì)形成細(xì)胞［8-9］，這些細(xì)胞完整表達(dá)角質(zhì)形成細(xì)胞標(biāo)記物，如角蛋白14和末端蛋白63，并可通過熒光標(biāo)記物抗體篩選出高純度的角質(zhì)形成細(xì)胞。iPS細(xì)胞定向分化的角質(zhì)形成細(xì)胞在體外能形成完整的表皮組織，種植在免疫缺陷小鼠同樣會(huì)產(chǎn)生完整的表皮。除角質(zhì)形成細(xì)胞，其他的人皮膚組成細(xì)胞如黑素細(xì)胞及成纖維細(xì)胞均可以由iPS細(xì)胞定向分化獲得［10-11］。將3種重要的皮膚細(xì)胞即角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑素細(xì)胞混合培養(yǎng)有可能產(chǎn)出完整的功能性人皮膚組織。

除可以產(chǎn)生表皮，iPS細(xì)胞技術(shù)還能用于獲得皮膚附屬器。有研究證實(shí)，人iPS細(xì)胞來源的外胚層祖細(xì)胞在體內(nèi)可以形成毛囊結(jié)構(gòu)。他們將iPS細(xì)胞來源的外胚層祖細(xì)胞和鼠毛乳頭細(xì)胞一起種植在免疫缺陷鼠，幾周后發(fā)現(xiàn)形成了新的毛囊［12-13］。iPS細(xì)胞技術(shù)使得獲得特定多潛能干細(xì)胞，并用于移植治療且無免疫排斥成為可能。

iPS細(xì)胞通過一種重組程序而獲得，這種重組程序能誘導(dǎo)一系列的干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入成熟體細(xì)胞，如真皮成纖維細(xì)胞，從初始誘導(dǎo)到iPS細(xì)胞特定的克隆形態(tài)形成大約需14～21 d，這些克隆除具有多能性，其另一重要特征是其可以無限的增殖。因此，可以通過一小塊皮膚組織標(biāo)本就能獲得無限的iPS細(xì)胞；然后又可將這些iPS細(xì)胞定向分化為各種類型的成體細(xì)胞。如將iPS細(xì)胞直接分化為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞。通過體外3D皮膚培養(yǎng)或體內(nèi)異種移植至免疫缺陷小鼠培養(yǎng)技術(shù)，可以運(yùn)用iPS細(xì)胞誘導(dǎo)獲得角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建皮膚組織［14-15］。目前的技術(shù)還能使研究者通過iPS技術(shù)來糾正遺傳性皮膚病中的基因突變，從而為基因遺傳性皮膚病患者進(jìn)行替代治療。這種技術(shù)的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是這種方法治療后的患者不會(huì)出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)。

3 iPS細(xì)胞結(jié)合基因編輯技術(shù)用于皮膚病的治療

目前的研究已證實(shí)，iPS細(xì)胞的一個(gè)重要特性是其具有無限增殖的能力，可以模擬出各種人類遺傳性皮膚病的疾病模型［14-15］。治療人類遺傳病的基本方案如下：①患者特定的iPS細(xì)胞可以由患者體細(xì)胞獲得；②如果有基因缺陷可通過基因打靶技術(shù)糾正患者iPS細(xì)胞的缺陷基因；③糾正后的iPS細(xì)胞被直接分化為目的細(xì)胞；④純化的目的細(xì)胞用于臨床移植治療。應(yīng)用iPS細(xì)胞技術(shù)治療遺傳性皮膚病是從該患者身上獲得基因突變的iPS細(xì)胞，通過基因糾正將iPS細(xì)胞定向分化為正常的皮膚組織細(xì)胞。這個(gè)過程中，基因突變須在體外糾正，可以通過特定序列DNA核苷酸來完成，設(shè)計(jì)這種核苷酸（如TALE核酸酶［16］）是為了切除特定的DNA序列。這些核苷酸通過包含正確DNA序列的質(zhì)粒被誘導(dǎo)入患者細(xì)胞，即同源組合就能使引起疾病的點(diǎn)突變得到修正［14-15］。基因糾正后的iPS細(xì)胞會(huì)提供一個(gè)理想的細(xì)胞來源，通過定向分化可獲得大量患者自身特定的（具有很好的免疫耐受性）健康皮膚的移植物，因此，這種基因糾正的方法可通過iPS細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。Tolar等和Osborn等［17-18］兩個(gè)研究組證實(shí)，可以從患有隱性遺傳全身性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥的患者獲得基因突變的iPS細(xì)胞。隱性遺傳全身性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥是由COL7A1基因突變引起的，該基因編碼膠原蛋白Ⅶ，導(dǎo)致皮膚水皰的形成。研究者先獲得患者iPS細(xì)胞，進(jìn)行基因糾正，然后由糾正后的iPS細(xì)胞定向分化獲得角質(zhì)形成細(xì)胞形成皮膚組織塊，因此，研究者能提供充足的證據(jù)證實(shí)，通過iPS細(xì)胞技術(shù)能為隱性遺傳全身性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥患者獲得大量臨床正常表皮。

4 iPS 細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)［19］

iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面均相似，因此，可以通過iPS細(xì)胞的無限增殖性等優(yōu)勢來研究正常人體的發(fā)育以及機(jī)體發(fā)生疾病的分子病理機(jī)制。然而，iPS細(xì)胞畢竟不等同于胚胎干細(xì)胞，在誘導(dǎo)以及體外培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)各種問題。

4.1 iPS技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：①iPS細(xì)胞可由少量的皮膚組織誘導(dǎo)獲得；②iPS細(xì)胞在體外可以無限的增殖，提供大量的細(xì)胞來源；③iPS細(xì)胞可以分化為各種細(xì)胞類型；④由iPS細(xì)胞分化獲得的細(xì)胞能用于疾病模型和藥物篩選；⑤基因突變引起的皮膚病可以在iPS細(xì)胞中糾正突變基因；⑥由iPS細(xì)胞衍生而來的細(xì)胞如角質(zhì)形成細(xì)胞可以用于細(xì)胞治療；⑦應(yīng)用iPS細(xì)胞分化的成體細(xì)胞避免了由胚胎干細(xì)胞引起的倫理問題。

4.2 iPS技術(shù)的缺點(diǎn)：①iPS細(xì)胞在體外重組培養(yǎng)的過程中可能會(huì)發(fā)生基因組的突變；②未分化的iPS細(xì)胞，如果輸入患者體內(nèi)會(huì)引起腫瘤（畸胎瘤）；③在臨床應(yīng)用之前，必須有標(biāo)準(zhǔn)化步驟來規(guī)范iPS細(xì)胞的產(chǎn)生、維持、分化等。

5 結(jié)語

研究者可以通過遺傳性皮膚病患者來源的iPS細(xì)胞定向分化獲得角質(zhì)形成細(xì)胞，同時(shí)獲得一些與基因突變引起的與疾病相一致的疾病模型系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)能在RNA、蛋白質(zhì)及功能水平評(píng)估疾病。此外，這種方法能獲得患者自身細(xì)胞基礎(chǔ)的篩選系統(tǒng)，從而使患者的角質(zhì)形成細(xì)胞缺陷獲得矯正成為可能。從長遠(yuǎn)來看，這種技術(shù)能用于產(chǎn)生患者自身來源的、基因糾正后的皮膚組織細(xì)胞，從而可移植到iPS細(xì)胞來源的患者。因此，這可能會(huì)為基因遺傳病，如皮膚皰病或皮膚變脆性疾病提供新的治療方案。

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Application of induced pluripotent stem cells in studies of skin diseases

Wu Jin,Yang Chunsheng,Zhou Wujun.Department of Dermatovenereology,Second People′s Hospital of Huai'an,Huai'an 223002,Jiangsu,China

Induced pluripotent stem cells （iPSCs） are generated through a process termed“reprogramming”,in which a set of transcription factors were introduced into multiple mature animal or human somatic cells.Since iPSCs are similar to embryonic stem （ES） cells in morphology,proliferation,surface antigens,gene and protein expressions,differentiation potency and so on,they are used instead of ES cells to study skin diseases.In addition to pluripotency,iPSCs also have indefinite proliferative potential,and specific cells can be achieved indefinitely by using the potentials of iPSCs to establish models for genetic skin diseases.Furthermore,pathogenic mutations can be corrected in iPSCs,which can then be used to generate gene-corrected normal skin cells for the treatment of genetic skin diseases.

Skin diseases;Induced pluripotent stem cells;Heredity;Genes;Therapeutic uses

Zhou Wujun,Email:pifukewujin@sohu.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.04.018

周武軍，Email:pifukewujin@sohu.com

本文主要縮寫：iPS細(xì)胞：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，Oct4：八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4，BMP4：成骨蛋白4，RDEB：隱性遺傳全身性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥

2015-08-10）