基因突變與骨髓增殖性腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展

王朋，秦松，柳長(zhǎng)柏，王君，鄒黎黎

(1.三峽大學(xué)人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化神經(jīng)科學(xué)&神經(jīng)再生修復(fù)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué)細(xì)胞治療研究所腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002)

基因突變與骨髓增殖性腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展

王朋1，2，秦松1，2，柳長(zhǎng)柏1，2，王君1，2，鄒黎黎1，2

(1.三峽大學(xué)人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化神經(jīng)科學(xué)&神經(jīng)再生修復(fù)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué)細(xì)胞治療研究所腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002)

骨髓增殖性腫瘤(MPN)是因?yàn)楣撬杷柘导?xì)胞增殖導(dǎo)致外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)增加的克隆性造血干細(xì)胞疾病。經(jīng)典的Ph染色體陰性MPN由真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)及原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)組成，研究發(fā)現(xiàn)PV、ET及PMF的發(fā)病機(jī)制與多種基因的突變密切相關(guān)，包括Janus激酶2(JAK2)、促血小板生成素受體的編碼基因MPL及鈣網(wǎng)蛋白CRT。因此，本文著重以JAK2、MPL及CRT的突變介紹基因突變與MPN的關(guān)系的最新研究進(jìn)展。

骨髓增殖性腫瘤；Janus激酶2；促血小板生成素受體編碼基因MPL；鈣網(wǎng)蛋白

骨髓增殖性疾病(Myeloproliferative disorder，MPD)屬于造血干/祖細(xì)胞惡性克隆性疾病，是由于骨髓中一系或多系造血細(xì)胞過度增長(zhǎng)，導(dǎo)致外周血中一種或多種血細(xì)胞形態(tài)和功能正常的計(jì)數(shù)增加，此概念由Dameshek等[1]于1951年第一次提出。2008年，WHO將MPD更改為慢性骨髓增殖性腫瘤，并將其分類到造血和淋巴腫瘤疾病[2]。典型MPN可分為慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)、真性紅細(xì)胞增多癥(Polycythemia vera，PV)、原發(fā)性骨髓纖維化(Primary myelofibrosis，PMF)和原發(fā)性血小板增多癥(Essential thrombocythemia，ET)[3]，隨病程進(jìn)展部分可轉(zhuǎn)化為其他疾病或各亞型之間相互轉(zhuǎn)化。MPN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，2005年之前僅有CML的發(fā)病被明確證明與Ph染色體密切相關(guān)，其余Ph陰性的MPN的發(fā)病機(jī)制尚不明確，且沒有特異性的分子診斷標(biāo)志；但自2005年起，陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)MPN患者中存在Janus激酶2(Janus Kinase 2，JAK2)、促血小板生成素受體的編碼基因MPL及鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin，CRT)的基因突變，且這些突變與MPN之間存在著密切的關(guān)系。

1 JAK2突變

Janus激酶(Janus kinase，JAK)屬于非受體型酪氨酸蛋白激酶，由JAK1、JAK2、JAK3及TYK2(Tyrosine kinase)構(gòu)成，其中，JAK2基因位于9p24，由7個(gè)高度保守的JAK同源結(jié)構(gòu)域(JAK homology，JH)組成[4]。羧基端包括JH1酪氨酸蛋白激酶區(qū)及JH2激酶相關(guān)區(qū)，氨基端含有FERM結(jié)構(gòu)域(JH3-JH7)，其功能是為與JAK2相互作用過程中的各種信號(hào)通路提供結(jié)合位點(diǎn)。值得注意的是，JH1是具有酪氨酸激酶活性激酶結(jié)構(gòu)域，JH2結(jié)構(gòu)域有正常激酶結(jié)構(gòu)卻無激酶活性，但在正常生理情況下自動(dòng)抑制JAK2酪氨酸激酶活性，對(duì)JH1激酶活性產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用[5]。下游信號(hào)只有經(jīng)過細(xì)胞生長(zhǎng)因子的刺激才可產(chǎn)生從而使造血細(xì)胞增殖、分化。一旦JH2結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化，其自身對(duì)JH1抑制功能解除，JAK2酪氨酸激酶持續(xù)活化，受體持續(xù)磷酸化，導(dǎo)致造血細(xì)胞持續(xù)增殖、分化，從而引發(fā)一些高表達(dá)疾病。

JAK2突變發(fā)生在JH2結(jié)構(gòu)域，原本位于12號(hào)外顯子中1849位鳥嘌呤G突變?yōu)樾叵汆奏，導(dǎo)致JAK2蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中蛋白質(zhì)錯(cuò)義編碼，617位纈氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸奖彼醄6]。JH2的自我抑制功能喪失，導(dǎo)致JAK2持續(xù)活化，使其在缺少配體的情況下與受體結(jié)合[7]，激活下游信號(hào)通路，導(dǎo)致造血細(xì)胞克隆性增殖，引起外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)增加[8]。James等[9]對(duì)MPN患者進(jìn)行基因?qū)W分析，于74例MPN患者(45例PV，17例ET，12例PMF)發(fā)現(xiàn)52例(40例PV，3例ET，9例PMF)存在JAK2 V617F突變，而對(duì)照組并未檢測(cè)到突變，并證實(shí)突變的JAK2可不依賴配體自發(fā)激活下游STAT信號(hào)通路。且發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞生長(zhǎng)因子刺激缺失的條件下，EPK/MAPK(Mitogen-activated protein kinase)和P13K/AKT通路能被激活，這些改變使凋亡減少，惡性細(xì)胞過度增殖。此現(xiàn)象表明，當(dāng)存在JAK2 V617F突變時(shí)，MPN的發(fā)病機(jī)理與JAK2的抑制能力的喪失具有高度相關(guān)性，Levine等對(duì)MNP患者進(jìn)行基因水平充分細(xì)致的研究，采用高通量基因測(cè)序法對(duì)JAK2進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)MPN患者存在V617F突變[4]；Quentmeier等[10]在對(duì)MPN致病機(jī)理進(jìn)行充分研究后發(fā)現(xiàn)，MPN致病過程包括原癌基因(JAK2V617F)的激活和抑癌基因(細(xì)胞因子2抑制劑，suppressor of cytokine signaling-2，SOCS2)的失活。

Baxter等[6]也調(diào)查證實(shí)，JAK2 V617F突變發(fā)生在97%的PV患者、57%的ET患者和50%的PMF患者中。Vainchenker等[11]發(fā)現(xiàn)2%～3%的PV患者不存在V617F等位基因的突變，卻含有JAK2的12號(hào)外顯子突變，JAK2V617F陰性的ET和PMF患者占大約40%。其中，3%～8%與促血小板生成素受體的編碼基因突變有關(guān)。

2 MPL突變

人血小板生成素(TPO)受體(TPOR)的編碼基因MPL位于染色體1p34上，其編碼的蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜及細(xì)胞外。其中，胞膜區(qū)與胞漿區(qū)連接處存在一段含有515位色氨酸的兼性K/RWQFP序列，其主要功能是維持MPL的細(xì)胞質(zhì)構(gòu)象，此序列的缺失會(huì)導(dǎo)致在不依賴配體的情況下，下游信號(hào)的持續(xù)性活化，而515位色氨酸的突變就可導(dǎo)致受體自發(fā)激活[12]。在3%～8%的ET患者和PMF患者中存在515位色氨酸的突變[13-14]。氨基酸錯(cuò)義突變導(dǎo)致不依賴TPO受體的活化信號(hào)的產(chǎn)生，其機(jī)制與MPL二聚體幾何構(gòu)象的改變有關(guān)[15]。位于胞膜區(qū)與胞漿區(qū)連接處的515位色氨酸在正常生理情況下抑制了MPL跨膜區(qū)的螺旋及阻止了受體的自發(fā)激活[16]。而515位色氨酸突變?yōu)槠渌被?，如亮氨酸、賴氨酸或精氨酸時(shí)，其抑制功能丟失導(dǎo)致了MPL持續(xù)活化；MPL蛋白表達(dá)水平的升高使得巨核細(xì)胞生成水平得到上調(diào)[17]，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

綜上可知，幾乎全部的PV與JAK2(97%與JAK2V617F突變相關(guān)，2%～3%與JAK2的12號(hào)外顯子突變相關(guān))突變相關(guān)；大約60%的ET和PMF與JAK2 V617F突變相關(guān)，此外3%～8%的ET和PMF與MPL相關(guān)。2008年，JAK2和MPL與MPN的密切關(guān)系使得WHO成員重新修訂了MPN的診斷標(biāo)準(zhǔn)[18]；但是，超過30%的ET和PMF缺乏常用的分子標(biāo)記，然而，2013年鈣網(wǎng)蛋白突變與MPN關(guān)系的發(fā)現(xiàn)彌補(bǔ)了該空白。

3 CRT突變

鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin，CRT)是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)[19]及細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核[20]的多區(qū)域多功能性蛋白質(zhì)，其最初是作為Ca2+結(jié)合伴侶分子被發(fā)現(xiàn)的[21]。CRT由三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成，包括一個(gè)球形的N端結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的序列；中間的P端結(jié)構(gòu)域，是一個(gè)高親和力、低容量的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)；一個(gè)強(qiáng)酸性的C端結(jié)構(gòu)域，具有高容量、低親和力的Ca2+結(jié)合功能。C端包含一個(gè)KDEL序列，含有KDEL序列的蛋白可從高爾基體回到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。CRT可與其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白(特別是鈣連接蛋白)協(xié)作干預(yù)，以確保蛋白質(zhì)和糖蛋白的正確折疊。鈣網(wǎng)蛋白與鈣聯(lián)接蛋白具有結(jié)構(gòu)同源性，并具有與鈣聯(lián)接蛋白循環(huán)相關(guān)的功能：即在N聚糖依賴性的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制過程中確保糖蛋白正確的折疊、降解和防止蛋白聚集[22]。

2013年12月，Nangalia等[23]和Klampf等[24]同時(shí)報(bào)道了在JAK2和MPL陰性的ET與PMF患者中發(fā)現(xiàn)CRT基因的異常突變，其比例占到60%～80%；至此，JAK2，MPL和CRT陰性(三陰性)的ET和PMF比例患者降低至15%以下。CRT的突變表現(xiàn)為：位于9號(hào)外顯子的插入和缺失，包括52 bp的缺失(Ⅰ型，占所有病例的45%～53%)，和5 bp TTGTC的插入(Ⅱ型，占所有病例的32%～41%)。突變可引起移碼，導(dǎo)致一個(gè)36個(gè)氨基酸序列取代正常C端序列中的27個(gè)氨基酸序列，形成了一個(gè)新的C末端，導(dǎo)致KDEL序列丟失。

在正常造血過程中，有關(guān)CRT突變介導(dǎo)的功能改變的相關(guān)報(bào)道很少，因此CRT突變是如何參與MPN的發(fā)生發(fā)展過程的在很大程度上仍然是未知的。但可以肯定的是，CRT突變導(dǎo)致MPN的關(guān)鍵致病因素與JAK/STAT信號(hào)有關(guān)，Klampfl等[24]研究表明，在白介素Ⅲ依賴性的鼠Ba/F3細(xì)胞中CRT del52的表達(dá)與STAT5磷酸化的增強(qiáng)相關(guān)，并使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為非細(xì)胞因子依賴性細(xì)胞；此外，JAK2抑制劑可抑制CRT突變細(xì)胞的生長(zhǎng)，且體外觀察與已報(bào)導(dǎo)的JAK2抑制劑治療CRT突變的MPN患者的結(jié)果相吻合[25]，其原因可能與細(xì)胞內(nèi)CRT執(zhí)行多種細(xì)胞功能有關(guān)。雖然通過CRT突變導(dǎo)致的JAK/STAT信號(hào)是異常復(fù)雜，但據(jù)現(xiàn)有研究表明在MPN中，CRT的突變與細(xì)胞功能紊亂具有相關(guān)性。

突變的CRT的C端缺乏KDEL序列，增加了細(xì)胞錯(cuò)誤定位的可能性，從而引起細(xì)胞功能的改變。關(guān)于突變CRT結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的生物信息學(xué)分析表明，突變的蛋白質(zhì)的C端失去結(jié)合Ca2+的能力，而這又可影響各種細(xì)胞功能[26]。此外，CRT/鈣聯(lián)接蛋白的缺陷也可能參與了造血祖細(xì)胞譜系的改變，導(dǎo)致巨核細(xì)胞譜系的優(yōu)先擴(kuò)增[27]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外野生型CRT定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞表面及細(xì)胞外液。然而，來自于骨髓增生異常綜合征患者的白血病祖細(xì)胞和發(fā)育異常的祖細(xì)胞顯示，CRT在細(xì)胞表面上表達(dá)上調(diào)；CRT表達(dá)在細(xì)胞膜上可能釋放出一個(gè)“吞噬我”的信號(hào)，最終被CD47的表達(dá)所抵消，從而影響對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬作用[28]。然而，在CRT突變的粒細(xì)胞，其在細(xì)胞表面的CRT含量并沒有顯著增加[23]。

CRT突變引起的ET和PMF使得MPN的發(fā)病機(jī)制的研究又向前跨越了一步，CRT使得ET和PMF的可檢測(cè)性超過85%，CRT突變的發(fā)現(xiàn)可顯著地影響MPN的實(shí)驗(yàn)研究、患者的診斷和管理、預(yù)后及治療方式等。既然2008年WHO修訂MPN的分類診斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，將JAK2和MPL的突變作為其主要標(biāo)準(zhǔn)[18]。因此，WHO有理由將CRT突變也納入MPN的診斷依據(jù)，與JAK2突變及MPL突變一起制定新的MPN診斷標(biāo)準(zhǔn)，并以CRT突變?yōu)橥黄泣c(diǎn)研發(fā)CRT抑制劑來治療CRT突變引起的MPN。

4 展望

JAK2突變的發(fā)現(xiàn)使Ph染色體陰性的MPN上升到分子診斷和分子靶向治療的層面[29]。MPL和CRT突變的發(fā)現(xiàn)使得MPN的診斷在JAK2突變的基礎(chǔ)上得以完善。隨著對(duì)它們?cè)贛PN中發(fā)病機(jī)制的深入了解將有助于患者的分型診斷，從而針對(duì)這些特異性分子標(biāo)記物開發(fā)出特異性靶向治療藥物，以改進(jìn)當(dāng)前的治療方案，改善患者的預(yù)后及生存率。然而，現(xiàn)已對(duì)MPN發(fā)病的分子機(jī)制有了足夠的了解，但有些機(jī)制還不盡完善，更有少于15%的MPN患者可能存在的基因突變和表觀遺傳學(xué)改變尚不明確；針對(duì)JAK2、MPL、CRT等分子水平異常的靶向治療藥物的開發(fā)以及藥物療效的確定，尚待下一步深入研究。

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Research development of the relationship between gene mutation and myeloproliferative neoplasms.

WANG Peng1,2,QIN Song1,2,LIU Chang-bai1,2,WANG Jun1,2,ZOU Li-li1,2.1.Translational Neuroscience&Neural Regeneration and Repair Institute/Institute of Cell therapy,People's Hospital of China Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei,CHINA;2.Hubei key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotheraph,Cell Therapy Research Institute,China Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei,CHINA

Myeloproliferative neoplasms(MPN)are a group of diseases characterized by increased proliferation of erythroid,megakaryocytic,or granulocytic cells.These disorders are caused by hyperproliferation of multiple hematopoietic lineages in the bone marrow.The Philadelphia-chromosome-negative classic chronic myeloproliferative neoplasms(MPN)include polycythemia vera(PV),essential thrombocythemia(ET),and primary myelofibrosis(PMF). Studies have found that the pathogenesis of PV,ET and PMF is closely related to a variety of gene mutations which including Janus kinase 2(JAK2),MPL and calreticulin(CRT).This paper focuses on the latest research progress of the relationship between gene mutations(JAK2,MPL and CRT)and MPN.

Myeloproliferative neoplasms;JAK2;MPL;Calreticulin

R733.3

A

1003—6350（2016）05—0774—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.05.030

2015-09-06)

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81201766）；湖北省教育廳基金（編號(hào)：Q20151204）

鄒黎黎。E-mail:zoulili@ctgu.edu.cn；王君。E-mail;wjtianxiafox@163.com