視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因治療的研究進(jìn)展

葛茸茸，沈奕伶，高　玉

·綜述與講座·

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因治療的研究進(jìn)展

葛茸茸，沈奕伶，高玉

[關(guān)鍵詞]視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；基因治療；研究進(jìn)展

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma, RB)來源于光感受器前體細(xì)胞，是小兒最常見、危害性最大的眼內(nèi)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅患兒的視力甚至生命，其發(fā)病率約為1/15 000～1/20 000，多見于嬰幼兒，6歲以前發(fā)現(xiàn)病情者占絕大多數(shù)[1]。RB早期可不影響視力，腫瘤一般體積很小且位于視網(wǎng)膜周邊部，很難及時(shí)、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)，容易漏診。多數(shù)患兒是在眼部出現(xiàn)癥狀以后才被注意，而此時(shí)確診，大多已是中晚期。傳統(tǒng)的治療主要是單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用眼球摘除術(shù)、外照射放射治療、局部治療等方法；化學(xué)減容法是保守治療的主要方法之一；局部治療主要有激光光凝、經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼ā⒐鈩?dòng)力療法、冷凍治療、鞏膜敷貼放療等。但上述方法往往缺乏針對性，存在特異性的破壞性損傷，安全性低、全身和/或局部不良作用嚴(yán)重，甚至發(fā)生腫瘤種植、誘發(fā)第二惡性腫瘤等諸多問題[2]。隨著腫瘤分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)的發(fā)展，加之眼球作為靶組織獨(dú)具的解剖優(yōu)勢，在RB治療領(lǐng)域，基因治療作為一種新型生物治療手段，呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景?，F(xiàn)將近年來RB基因治療的研究進(jìn)展作一綜述。

1RB基因替代療法

RB的發(fā)病與Rb基因的缺失或失活密切相關(guān)。Rb基因是隨著RB的研究而最早被發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物在人體內(nèi)發(fā)揮著諸如調(diào)節(jié)分化、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期等重要作用。Rb基因與其蛋白表達(dá)物的失活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂不受控制地、非正常地增長而發(fā)生永生化，最終引發(fā)腫瘤。對于家族遺傳性患者，其出生前生殖細(xì)胞中的Rb基因已經(jīng)發(fā)生過一次突變，還有一個(gè)正常的等位基因沒有發(fā)生突變，但該正常等位基因通常會(huì)由于偶然的原因失活，進(jìn)而引發(fā)癌癥；對于非家族性遺傳患者而言，需要發(fā)生兩次突變才會(huì)發(fā)病，這種幾率相對較低；其他的突變類型包括無功能突變、啟動(dòng)子突變等。針對缺失或失活Rb基因的治療策略，不僅對患病個(gè)體的臨床治療有重要作用，對患病個(gè)體的兄弟姐妹以及后代患病狀況的監(jiān)測同樣具有重要意義。Xu等[3]的研究顯示，將外源性Rb基因?qū)隦B細(xì)胞，替代其缺陷Rb基因，能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長，同時(shí)還能抑制腫瘤細(xì)胞永生化所必需的端粒酶活性，進(jìn)而導(dǎo)致RB腫瘤細(xì)胞死亡。但目前，RB基因替代療法的作用僅限于被轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞，如何改進(jìn)治療基因的傳遞載體、提高腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，已成為其療效的關(guān)鍵點(diǎn)。RB有很高的自發(fā)退變率，是其他惡性腫瘤的近千倍[4]，這似乎預(yù)示著腫瘤完全有可能被攻克。人體細(xì)胞自身就存在對腫瘤細(xì)胞生長具有拮抗作用的抑癌基因等相關(guān)因子，能否揭示RB發(fā)病及自發(fā)退變的機(jī)制，已成為攻克RB及其他惡性腫瘤的關(guān)鍵。

2導(dǎo)入抑癌基因治療

除Rb基因外，p53和p21等抑癌基因的突變與失活，對RB的發(fā)生、發(fā)展，同樣也起著非常重要的作用。p53基因作為與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，至今被認(rèn)為是機(jī)體抵抗癌癥的主要防線。自1979年起的十多年時(shí)間里，人們對 p53基因的認(rèn)識，主要經(jīng)歷了癌蛋白抗原、癌基因到抑癌基因等3個(gè)階段。目前已經(jīng)公認(rèn)，具有促進(jìn)腫瘤形成或細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用的p53蛋白，是p53基因突變的產(chǎn)物；野生型p53基因是一種抑癌基因，但在發(fā)生突變或失活后，不僅不能抑制腫瘤增殖，反而會(huì)具備癌基因的相關(guān)功能。p21基因?qū)儆诩?xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑家族，在細(xì)胞周期控制及腫瘤發(fā)生方面具有重要作用。Audo等[5]將p53和p21分別導(dǎo)入RB細(xì)胞，均能抑制腫瘤細(xì)胞生長和促進(jìn)凋亡。國內(nèi)亦有研究顯示[6]，野生型p53基因具有抑制RB細(xì)胞生長的作用。p53基因能抑制腫瘤細(xì)胞生長、促使腫瘤細(xì)胞凋亡，還能幫助細(xì)胞基因修復(fù)缺陷，但這一功能對于因化療藥物等作用而受傷的腫瘤細(xì)胞，卻又起到修復(fù)作用，從而造成被修復(fù)的腫瘤細(xì)胞在治療后成為新的腫瘤。

3自殺基因治療

自殺基因又稱前體藥物酶轉(zhuǎn)化基因，自殺基因治療的原理是將某些病毒或細(xì)菌的基因(既自殺基因)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，該基因表達(dá)的酶催化無毒或低毒的藥物前體代謝為細(xì)胞毒性物質(zhì)，干擾受體腫瘤細(xì)胞DNA合成，從而引起腫瘤細(xì)胞的自殺效應(yīng)[7]。單純皰疹病毒胸苷激酶/丙氧鳥苷(HSV-TK/GCV)系統(tǒng)，既將單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，聯(lián)合應(yīng)用更昔洛韋，進(jìn)行自殺基因治療，目前被認(rèn)為是針對玻璃體腔內(nèi)種植性RB最為有效的一種治療方法。Hurwitz等[8]研究表明，含胸苷激酶自殺基因的重組腺病毒(ADV-TK)聯(lián)合更昔洛韋，能有效殺死人RBY79細(xì)胞。張永紅等[9]研究腫瘤特異性雙自殺基因載體pc-ChCDTK對人RBY79細(xì)胞的體外殺傷作用，其結(jié)果顯示，雙前體藥物的殺傷作用明顯大于單前體藥物。自殺基因治療具有“旁觀者效應(yīng)”，不僅導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細(xì)胞自身被殺死，與其臨近或遠(yuǎn)處未被轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞，也會(huì)因?yàn)槎拘晕镔|(zhì)通過細(xì)胞間縫隙連接的轉(zhuǎn)運(yùn)而被殺死?！芭杂^者效應(yīng)”彌補(bǔ)了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低的缺陷，有效增強(qiáng)了自殺基因的殺傷效能。正常的免疫系統(tǒng)可能對“旁觀者效應(yīng)”起著重要作用[10]。自殺基因治療有著良好的應(yīng)用前景，但要真正用于臨床，諸如對眼內(nèi)正常細(xì)胞的不良作用等許多問題還有待深入研究和解決。靶向性傳遞自殺基因至靶細(xì)胞，“旁觀者效應(yīng)”僅對未轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞起作用，可能是自殺基因治療將來的一個(gè)重要發(fā)展方向。

4抗血管生成基因治療

腫瘤生長依賴新生血管形成以獲取營養(yǎng)、氧氣及排出廢物；當(dāng)實(shí)體腫瘤直徑達(dá)到或超過1～2 mm，由于新生血管的形成與長入，腫瘤組織將迅速生長，其浸潤和轉(zhuǎn)移能力也將不斷增強(qiáng)，若無新生血管，腫瘤組織則發(fā)生退化[11]。新生血管還能為腫瘤細(xì)胞提供轉(zhuǎn)移通道?？寡苌苫蛑委熞阅[瘤新生血管為靶點(diǎn)，將相關(guān)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤及其周圍組織，通過抑制新生血管生成切斷腫瘤生長、轉(zhuǎn)移所依賴的營養(yǎng)微環(huán)境，既以“饑餓療法”達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞、治療腫瘤的目的[12]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)，是唯一特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管調(diào)控因子，能直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)遷移及管腔樣結(jié)構(gòu)形成，還能增加微血管的通透性[13]。有研究證實(shí)，VEGF在RB組織中高表達(dá)，且能促進(jìn)RB的惡性進(jìn)程[14]。以VEGF作為治療靶點(diǎn)的抗血管生成基因治療，已成為目前治療RB的重要策略之一。但腫瘤血管的生成，是促血管生成因子和抑制因子協(xié)調(diào)作用、共同參與的復(fù)雜過程，僅針對某個(gè)單一血管調(diào)控因子，是很難真正完全性抑制腫瘤血管生成的。即便實(shí)體腫瘤因有效治療，體積縮小到一定程度，但幸存腫瘤細(xì)胞可從組織間液獲取營養(yǎng)。故而，單純依靠抗血管生成基因治療很難徹底根除腫瘤。抗血管生成基因治療需與化療、放療或手術(shù)等其他方法聯(lián)合實(shí)施。有觀點(diǎn)認(rèn)為，血管生長抑制劑和細(xì)胞因子免疫療法的聯(lián)合應(yīng)用，可能成為根治惡性腫瘤的有效手段[15]。

5促凋亡基因治療

黑色素瘤分化相關(guān)基因-7(MDA-7)，又被稱為白細(xì)胞介素-24(IL-24)，通過抑制血管生成、激活生長抑制DNA損傷基因(growth arrest and DNA damage,GADD)等途徑，選擇性殺死腫瘤細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞增殖阻滯及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。將編碼MDA-7的腺病毒載體導(dǎo)入RB組織(CB/17SCID鼠皮下RB模型)，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，腫瘤體積明顯縮小[17]，MDA-7/IL-24有望成為RB基因治療的重要因子。由于MDA-7蛋白可對周圍未受轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生“旁觀者效應(yīng)”[18]，采用MDA-7的促凋亡基因治療，存在與自殺基因治療類似的毒副作用。

6溶瘤性單純皰疹病毒基因治療

溶瘤病毒基因治療通過病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制增殖，造成腫瘤細(xì)胞裂解而殺死腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞裂解后釋放出來的病毒又可進(jìn)一步感染周圍的腫瘤細(xì)胞，具有級聯(lián)放大作用。溶瘤單純皰疹病毒(HSV)是目前抗腫瘤作用最好的一種溶瘤病毒，沉默γ 34.5基因或核糖核苷酸還原酶基因的HSV突變株，能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解性死亡[19]。以往曾有多項(xiàng)關(guān)于HSV突變株應(yīng)用于RB治療的報(bào)道：HSV突變株對LHβTAg轉(zhuǎn)基因小鼠RB動(dòng)物模型的療效有限[20]；其復(fù)制僅局限于惡性病灶區(qū)和視網(wǎng)膜色素上皮(病毒抗原免疫組化檢測)[21]。而Kogishi等[22]的體外實(shí)驗(yàn)卻提示，HSV突變株可在人RBY79細(xì)胞中復(fù)制且具有溶瘤細(xì)胞作用。這些研究結(jié)果的差異可能與實(shí)驗(yàn)對象(RB細(xì)胞、動(dòng)物模型)的不同有關(guān)。由于HSV突變株存在引起受體眼部炎癥、免疫和毒性反應(yīng)的可能[23]，其應(yīng)用也受到了一定的限制。

綜上所述，基因治療是通過糾正或補(bǔ)償致病基因的缺陷，關(guān)閉或抑制異?；虻谋磉_(dá)，而得以實(shí)現(xiàn)治療RB的目的。眼內(nèi)微環(huán)境相對獨(dú)立于體循環(huán)系統(tǒng)，降低了轉(zhuǎn)基因載體全身蔓延的幾率，能有效減少甚至避免全身不良反應(yīng)，相比其他部位的腫瘤，RB選擇基因治療具有一定優(yōu)勢。但在憧憬基因治療應(yīng)用前景的同時(shí)，尚不可忽視，基因治療還不能完全殺死腫瘤細(xì)胞，應(yīng)用于眼局部仍會(huì)出現(xiàn)炎癥、免疫和毒性反應(yīng)，對鄰近RB正常細(xì)胞的不良反應(yīng)仍有待解決，尤其，病毒載體本身及外源基因隨機(jī)整合也會(huì)給受治者帶來潛在危害。

總之，RB基因治療離真正應(yīng)用于臨床還有一定距離，隨著科技的進(jìn)步和研究的深入，基因治療將向著安全性、精密性、靶向性和高效性方向不斷發(fā)展，以基因治療為主體的綜合治療策略將得到不斷完善，最終實(shí)現(xiàn)不僅要挽救RB患兒生命、保留眼球，還要保存有用視力以提高其生活質(zhì)量。

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(本文編輯：莫琳芳)

[作者單位]200081上海，解放軍第四一一醫(yī)院眼科

[中圖分類號]R774.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1009-0754.2016.03.040

(收稿日期：2015-12-25)