ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白及應對抗生素耐藥性的概述

任遠 司維 任恒 李沖 李璐璐 王霆(河南省人民醫(yī)院藥學部 河南鄭州 450003)

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ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白及應對抗生素耐藥性的概述

任遠 司維 任恒 李沖 李璐璐 王霆
(河南省人民醫(yī)院藥學部 河南鄭州 450003)

【關鍵詞】細菌;耐藥泵;治療手段

細菌已經(jīng)衍生出許多巧妙的策略來抵抗微生物的治療:靶點修飾,藥物失活,酶降解,或者是降低細胞內(nèi)藥物濃度(亦或是降低穩(wěn)定性?促進藥物的外流)?在這諸多策略之中,外流策略是最為普遍也最為基礎的機制,然而目前而言,這種機制似乎最為重要是因為它具有授予細菌多重耐藥性(MDR)表現(xiàn)型的能力,從而導致一些細菌株能夠?qū)δ壳八幸阎闹委煯a(chǎn)生耐藥性[1]?在外泵機制中所起作用最顯著和廣泛的當屬ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族(ATP-binding cassete transporter proteins,ABC Protein)?本文將就原核生物中ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構,它們與抗生素耐受性以及與抗細菌治療策略的關系展開論述?

1 簡介

外流泵參與了細菌內(nèi)許多生理功能:它們主要被視為“細胞清潔者",但它們同樣在細菌致病過程中發(fā)揮重要作用[2]?在抗生素治療的壓力下,它們會發(fā)生高表達從而提高抗生素的最小抑菌濃度(MIC),使耐藥性機制進一步加強,最終導致抗菌治療的失敗?由于一些轉(zhuǎn)運分子是由可移動的基因片段所編碼,導致這種耐藥性機制會在種內(nèi)和種間迅速傳播,從而進一步增加尋找合適治療方案的難度,并對環(huán)境中細菌耐藥性的免疫因子施加了選擇性的壓力[3]?

細菌外流轉(zhuǎn)運蛋白主要是由Ⅱ-型轉(zhuǎn)運蛋白(取決于質(zhì)子動力或是鈉離子動力)組成?Ⅱ-型轉(zhuǎn)運蛋白主要屬于以下幾個蛋白家族:多藥及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運蛋白(MATE),主要協(xié)助轉(zhuǎn)運蛋白超家族(MDF),抗結(jié)核分離蛋白(RND)以及小多重耐藥性轉(zhuǎn)運蛋白(SMR)家族?然而,ABC家族的MDR轉(zhuǎn)運蛋白在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中均已見報道[4],并且對于原核菌種的大量基因分析工作使許多假想的ABC家族的外流泵得到了證實[5]?最近,一個細菌ABC蛋白(與多重耐藥性相關)的晶體結(jié)構已被測定,使能量耦合與轉(zhuǎn)運的分子機制得以被窺探[6-7]?許多ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白都與抗生素耐受性有關;在它們當中,有一些授予了細菌以多重耐藥性的表現(xiàn)型,使細菌表現(xiàn)出對于多種?混合的抗生素的耐藥性?最近,在對轉(zhuǎn)基因植物的抗生素保護中,一種植物來源的ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白被作為耐受性的決定因素加以使用;結(jié)果表明,當該種ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白過度表達時,植物對于卡那霉素產(chǎn)生了顯著的耐受性,說明這些外流系統(tǒng)或許可以有效地保護活體細胞免于抗生素的作用[8]?

2 細菌中的ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白確與抗生素耐受性有關

首見報道的與抗生素耐受性有關的細菌ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白是MsrA,一種從葡萄球菌中分離得到?由質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)運蛋白?這種轉(zhuǎn)運蛋白與細菌對14/15碳大環(huán)內(nèi)酯類抗生素?B-型鏈陽霉素的耐受性有關[9]?90年代初細菌產(chǎn)生多重耐藥性的機制就已在二級反向運輸系統(tǒng)中見報道[10],首次發(fā)現(xiàn)與多重耐藥性有關的細菌ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白是1996年在乳球菌中得到的LmrA[11]?似乎這些二級蛋白與抗生素耐受性?抗菌治療的失敗有所關聯(lián)(特別是革蘭氏陰性菌種來自MFS和RND蛋白家族的二級蛋白)?這些多重耐藥性轉(zhuǎn)運蛋白中的許多都被研究過,例如金黃色葡萄球菌中的NorA,或者是綠膿桿菌中的MexAB-OprM系統(tǒng)?并且,現(xiàn)已發(fā)展了許多規(guī)避上述蛋白的治療策略?

然而近些年,對于細菌ABC家族外流系統(tǒng)對抗生素耐受性的貢獻卻少有報道?并且這些轉(zhuǎn)運蛋白在抗生素生產(chǎn)器官中的作用主要被認為是分泌藥物并對生成的抗生素產(chǎn)生自衛(wèi)性?耐受性[12]?如今,隨著許多菌種的基因測序工作已經(jīng)全部完成,分子生物學技術(基因敲除與過度表達研究)也得到長足進步,大量假象的ABC家族的轉(zhuǎn)運蛋白已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)?它們當中越來越多被證實與許多菌株的抗生素耐受性有關?所有這些轉(zhuǎn)運蛋白都表現(xiàn)出顯著水平的抗生素耐受性(對照組與轉(zhuǎn)運蛋白表達的組之間MIC值至少有4倍的差異)?幾乎每類抗生素都受到了影響,并且ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白催化的抗微生物藥物的主動外流過程,在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌種均有發(fā)生?在所有被發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)運蛋白之中,很少被視為是多重耐藥性蛋白[13],而是更多地被稱為小MDR蛋白(SDR)?在考慮藥物治療策略時,多重耐藥性泵更為重要,因為它們與細菌對多種抗生素的適應過程有貢獻,從而導致產(chǎn)生越來越多的菌種特異性耐藥機制,最終可能產(chǎn)生十分耐受的菌株,對臨床研究和社會防治都產(chǎn)生巨大的威脅?

被研究最多的細菌ABC家族多重耐藥性轉(zhuǎn)運蛋白是乳酸菌中的LmrA?這個基因編碼的蛋白與人體的P-糖蛋白(P-gP)具有結(jié)構上的同源性,然而其與P-gP不同的是,Lm rA是由兩個半轉(zhuǎn)運蛋白構成,并以同源二聚體的形式發(fā)揮功能[14]?這種轉(zhuǎn)運蛋白在藥物耐受的大腸桿菌株中表達,并發(fā)現(xiàn)其可導致對多種抗生素和其他藥物(這些藥物在結(jié)構上和功能上都無聯(lián)系)的耐受性?其他的具有廣譜底物親和性的多重耐藥性ABC家族泵也在細菌中得以發(fā)現(xiàn),然而此處我們只關注那些與臨床使用抗生素耐受性相關的多重耐藥性ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白?基于如此意圖,缺少一些主要多重耐藥性轉(zhuǎn)運蛋白的耐藥菌株將會是非常棒的工具,從而用于確定多重耐藥性外流泵的潛在底物范圍?其他主要的與抗生素耐受性有關的多重耐藥性ABC家族外流泵包括EfrAB?VcaM和MacAB?鑒于其命名和底物范圍,后面兩種更像SDR轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員?為了紀念這個發(fā)現(xiàn),這兩種耐受且不斷增長的菌株被分別命名為SP2073和SP2075[15]?

細菌中多重藥物的外流機制正被廣泛討論,而且?guī)缀鯚o爭議地認為多重藥物的外流泵是染色體編碼的,然而藥物特異性的外流機制似乎更可能是質(zhì)?；蛘咂渌梢苿拥幕蚱?如轉(zhuǎn)位子,干擾素)編碼的?后一種機制促進了菌種間的橫向轉(zhuǎn)移,并且使得耐受性決定因素如外流泵得以迅速分散傳播[16]?這一情況加重了多重耐受性(無論是致病菌還是非致病菌)菌種的發(fā)展情況,甚至可能導致公眾健康的隱患,成為一個環(huán)境問題?

3 ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白在抗微生物治療策略中的應用

在人類治療方面,ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白對于抗腫瘤藥物的研究是不可缺少的?關于抗菌治療,MDR和外排方面的興趣(關注)在近10 a得到提升,這個現(xiàn)象,現(xiàn)在被認為是固有的和同樣伴隨過表達,作為一種獲得性耐藥機制,很大程度上造成現(xiàn)在抗生素治療的弱點?特別是細菌次生轉(zhuǎn)運蛋白驅(qū)動的外排,大部分研究已經(jīng)開展或正在進行中[17]?細菌的ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白很少被關注因為它們涉及抗生素外排的描述較少?盡管如此,最近在分子生物學和細菌基因工程方面的發(fā)現(xiàn)和進展,提供了對于細菌外排過程的一個更好認識?隨著越來越多轉(zhuǎn)運蛋白被鑒定,ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白似乎在多藥(包括抗生素)耐藥方面發(fā)揮著不可忽視的作用?同樣,其在環(huán)境適應和細菌生存方面具有相應的重要性,結(jié)合現(xiàn)在的三維結(jié)構解析,使它們成為新抗菌策略的潛在靶點?

3.1 細菌的ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白作為免疫治療的靶點 眾所周知,ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白可能具有免疫原性,特別是位于表面的蛋白像外膜蛋白(OMPs)和(或)SBPs,提示它們可能被開發(fā)成針對治病菌株的疫苗的候選亞基?針對這些蛋白增加的重組抗體在感染小鼠模型的細菌中減少[18]?因此,有可能通過使用DNA疫苗使細菌過表達這些免疫原性的成分?這些疫苗的例子已經(jīng)被用來評價分枝結(jié)核桿菌感染,這些針對靜脈內(nèi)感染的有效保護通過使用PstS-3得到證實,PstS-3是涉及磷酸鹽轉(zhuǎn)運的結(jié)核分枝桿菌SBP中的一種[19]?

ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白組分位于革蘭陰性菌的細胞膜內(nèi),同樣能夠刺激特定免疫反應,因為靶向細胞質(zhì)蛋白的抗生素已經(jīng)用于恢復期血清(convalescent sera)[20]?進一步研究需要確認位于膜內(nèi)的蛋白刺激抗體反應的過程?這個將提供更多的把ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白作為DNA疫苗的合理方法?

此外,當用于和抗生素聯(lián)用時免疫治療可能得到加強?針對甲氧西林耐藥S.aureus(EMRSA-15)ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白肽提高的重組蛋白和萬古霉素的聯(lián)用已經(jīng)結(jié)束3期臨床實驗,這個藥物聯(lián)用的所有反應(細菌和臨床)比安慰劑和萬古霉素聯(lián)用觀察到的結(jié)果好?

3.2 逆轉(zhuǎn)外排機制造成的細菌耐藥性 在治療細菌耐藥的過程中,面對MDR耐藥基因或者外排機制引起的耐藥性,除了發(fā)展新型的對外排泵不敏感的藥物,幾乎所有的策略都是選擇一種“外排泵抑制劑"與抗生素聯(lián)用來達到逆轉(zhuǎn)臨床上治療耐藥菌時產(chǎn)生的局限性[21]?這個思路極具合理性和前景,原因如下:①幾乎所有抗生素都產(chǎn)生了多藥耐藥現(xiàn)象(即使近來上市應用到臨床的,如奎奴普丁-達福普汀,泰利霉素,替吉環(huán)素和利奈唑胺等);②應用于合用策略的抗生素已經(jīng)證實他們在野生型菌株上的有效活性,并且已經(jīng)有很豐富的毒性和生物利用度等相關數(shù)據(jù)資料的積累;③臨床上已經(jīng)證實一些耐藥抑制劑與抗生素的聯(lián)合應用非常有效,比如克拉維酸鉀/阿莫西林就廣泛應用于臨床治療上?為了在細菌細胞內(nèi)積聚更多的藥物,外泵抑制劑可以促進藥物的攝入或者抑制外泵對藥物的排出,在過去20多年的基礎研究和工業(yè)制造上,這兩種方案被廣泛采用,并且繼續(xù)指導著抗菌藥物的未來研發(fā)和應用?

3.2.1 增加抗生素的攝入 提高藥物的攝入有多種方法,其中之一就是將抗生素與細菌ABC家族攝入蛋白的天然底物連接起來?針對蛋白攝入系統(tǒng)設計的藥物早已有報道[22]?這個方法對原核生物有較高的特異性,因為設計時不得不遵循一個有趣的限制:設計的復合物的大小必須在攝入蛋白的轉(zhuǎn)運能力范圍之內(nèi)[23]?盡管如此,這個創(chuàng)意提出了一個極具潛力的解決辦法?因為ABC攝入蛋白對原核細胞具有特異性,并且這些蛋白的三維結(jié)構最近已經(jīng)被確定,基于這些有利條件,針對ABC攝入系統(tǒng)開發(fā)的抗菌藥物將在未來具有廣闊前景?

3.2.2 降低抗生素的外排 近年來有兩個方法被嘗試減少或者消除外排泵的泵出抗生素能力?

3.2.2.1 具有生物活性的外排抑制劑 具有生物活性的外排抑制劑能夠影響外排基因的表達,在這種情況下,外泵促進劑與抑制劑能夠作為研究外泵蛋白生物活性的有效工具,并且能夠為耐藥的問題提供潛在的方案[24]?盡管如此,這個方法也有明顯的局限性,因為具有調(diào)節(jié)功能的分子通常不僅僅作用于一個基因靶點,所以很可能會產(chǎn)生不可預期的結(jié)果?

3.2.2.2 具有藥理活性的外排抑制劑 藥理活性抑制劑可能通過非特異性和特異性的途徑發(fā)揮作用,包括以下3個方面:①削弱能量和轉(zhuǎn)運(僅限于間接的轉(zhuǎn)運蛋白,ABC蛋白家族依賴消耗ATP的主動運輸);②干擾外排泵活性(僅可能限于革蘭氏陰性菌和ABC蛋白家族,如MacAB-TolC);③能夠競爭性或者非競爭性的作用于外泵蛋白?最后一點是在藥物化學研發(fā)中采用最廣泛的途徑,并且許多高效的外泵抑制劑的化學結(jié)構已經(jīng)被確證[25]?

在真核細胞多藥耐藥性問題中,外泵抑制劑被廣泛研究,盡管在臨床上只有環(huán)孢菌素付諸應用?因為真核細胞中的P-gp基因與一些細菌中的ABC家族蛋白如LmrA有高度同源性,所以研究中發(fā)現(xiàn)有些分子能夠同時抑制真核細胞和原核細胞的外泵蛋白活性?例如,作為用真核細胞的外排泵抑制劑實驗模型的工具藥維拉帕米,以及作為原核細胞的外排泵抑制劑實驗模型的工具藥利血平,二者均能夠抑制兩種外排泵的活性?所以,由天然產(chǎn)物尋找或者化學途徑合成ABC家族外泵抑制劑面臨著一個重要的挑戰(zhàn):為避免副作用,必須尋找對原核細胞具有特異性的化合物?現(xiàn)在,憑借一些轉(zhuǎn)運蛋白的三維結(jié)構模型,這些問題有希望被解決?所以,當前最多的精力集中在那些間接轉(zhuǎn)運蛋白的研究,比如MFS(NorA),SMR(Em-rE),MATE(NorM),或者RND(MexAB-OprM),證實考慮到這些蛋白及其結(jié)構是細菌所特有的?

綜上,為了達到克服細菌外排作用引起的耐藥性,需要收集和整合更多的外泵系統(tǒng)的三維結(jié)構,藥理功能,基因編碼和上下游調(diào)控蛋白的數(shù)據(jù)資料,并且針對來源于植物和化學合成的化合物進行基于細胞水平的大量篩選?同時,將主要的藥物設計靶點,尤其是攝入系統(tǒng)的靶點,選為ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白,對未來發(fā)現(xiàn)新的高效低毒且具有特異性的耐藥抑制劑有著光明前景?

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(收稿日期:2015-09-07)

通訊作者:司維,E-mail:35674214@qq.com?

【中圖分類號】Q 51

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.01.036