淺談豬IRF6基因的克隆和組織分布

湯存麗

摘 要：本試驗利用該基因的電子克隆序列設(shè)計了一對引物，通過RT-PCR的方法對IRF6基因進行克隆，并對擴增結(jié)果鑒定；以及檢測其在各組織中的分布情況。

關(guān)鍵詞：IRF6；克隆；RT-PCR；組織分布

IRF6基因由10個外顯子組成，第1、10外顯子及部分第9外顯子不翻譯；IRF6由467個氨基酸殘基組成。該基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子家族，這一家族由9個成員組成，他們的共同點是都由一個高度保守的螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋的DNA結(jié)合域和一個相對保守的蛋白質(zhì)結(jié)合域組成的。

大多數(shù)IRF基因在病毒感染后調(diào)節(jié)干擾素和8的表達，對IRF6的功能認識相對落后.J.Knight等分析了小鼠和雞面部發(fā)育時的IRF6基因的表達，結(jié)果表明在面部融合形成上唇和原發(fā)顎的過程中均有該基因表達，證實了IRF6在唇顎部發(fā)育融合過程中起作用。Viera等的研究則認為IRF6與牙齒發(fā)育不全關(guān)系密切。2006年，Ingraham等建立了IRF6基因敲除的小鼠模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因敲除的小鼠，其皮膚、四肢和面部均表現(xiàn)異常。組織學(xué)和基因表達分析表明，IRF6在調(diào)節(jié)角質(zhì)細胞的增值和分化中起了很重要的作用，說明IRF家族在表皮發(fā)育過程中有新的功能。實驗結(jié)果的動物取材為--80℃冰箱保存的肚長大三元豬的各部位組織。取豬的肌肉組織用于目的基因克??；取豬心、肝、脾、肺、腎、空腸、十二指腸、回腸、腦、肌肉、皮膚、脂肪、胸腺、淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)、子宮、睪丸17種組織用于組織分布研究。

一、實驗結(jié)果與分析

（一）樣品中總RNA的檢測結(jié)果

樣品經(jīng)微量分光光度計定量，所得OD260/OD280值在1.8～2.0之間，表明純度較好，無蛋白質(zhì)和DNA污染，實驗提取的RNA的純度可用來合成cDNA。

（二）cDNA擴增

產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，樣品在約1400bp處有一條清晰條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（見圖1）

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

M是marker，指標記，1-4指樣品

（三）菌液PCR鑒定

按陽性克隆的篩選與鑒定方法進行菌液PCR鑒定，用組織分布的引物做菌液PCR擴增，結(jié)果如圖2所示。從圖2可見，2、3、5、6、7、8號這7個樣品在250bp左右處有清晰條帶。即2、3、5、6、7、8號有陽性克隆。

圖2 菌液PCR電泳圖

M是marker，指標記，1-8指樣品

（四）豬IRF6的組織分布

采用RT-PCR的方法以β-action 基因為內(nèi)參在豬的17種組織中研究了IRF6基因在豬不同組織中的表達規(guī)律，擴增片段用瓊脂糖電泳檢測（如圖3）。發(fā)現(xiàn)IRF6基因在胸腺組織中有較高水平的表達，在心、脾、肺、皮膚、脂肪、淋巴、頜下淋巴、子宮、睪丸組織中表達量相對較少，在肝、腎、空腸、十二指腸、回腸、腦、肌肉組織中不表達。

圖3組織分布電泳圖

1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.腎；6.空腸；7.十二指腸；8.回腸；9.腦；10.肌肉；

11.皮膚；12.脂肪；13.胸腺；14.淋巴；15.頜下淋巴；16.子宮；17.睪丸

二、討論IRF6的病理學(xué)意義

基因突變可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳的Van der Woude綜合征（VWS）或相關(guān)的翼狀胬肉綜合征（PPS）。Van der Woude綜合征包括唇腭裂特征和牙齒異常和唇瘺。此外，在IRF6常見等位基因也已通過全基因組關(guān)聯(lián)研究和許多候選基因的研究與唇腭裂的非綜合征性有關(guān)。這些疾病是由IRF6基因突變引起的一些表型的異質(zhì)性是由于不同類型的IRF6基因突變。在綜合征表型變異的一個解釋是基于對二聚化的突變體蛋白的結(jié)構(gòu)差異的影響。VWS出現(xiàn)突變，導(dǎo)致單倍劑量不足而PPS的突變可能是顯性負。在VWS和PPS的突變譜最近已總結(jié)。IRF6已被證明在角質(zhì)形成細胞的發(fā)育中起著重要的作用。IRF6的功能是與結(jié)締組織的形成有關(guān)，例如口感。

三、IRF6基因在各組織中表達的結(jié)果及意義

試驗采用RT-PCR的方法研究了IRF6基因在豬不同組織中的表達規(guī)律。在試驗中，IRF6基因在檢測的17種組織中分布具有很大的差異性，實驗結(jié)果表明IRF6基因在在胸腺組織中有較高水平的表達，在心、脾、肺、皮膚、脂肪、淋巴、頜下淋巴、子宮、睪丸組織中表達量相對較少，在肝、腎、空腸、十二指腸、回腸、腦、肌肉組織中不表達。分析試驗結(jié)果可知，IRF6基因在胸腺組織中表達突出，胸腺為機體的重要淋巴器官，對免疫、分泌胸腺激素及激素類物質(zhì)有很大的影響，在脾、淋巴、皮膚等組織中均有表達，而淋巴組織構(gòu)成動物體抵抗病原菌入侵的第二道防線，脾構(gòu)成第三道防線，這表明IRF6基因有較大可能在豬的免疫防御系統(tǒng)中起著重要作用。另外，該基因在子宮和睪丸中都有一定的表達，這預(yù)示著IRF6基因的表達在性腺中無性別差異； 肺是動物的呼吸器官，肝是動物的最大消化腺，并且IRF6基因在豬的肺和肝中都有一定量的表達，這表明IRF6基因有可能在豬的呼吸運動和消化作用的細胞性活動中起著一定的抑制作用； 而在空腸、十二指腸、回腸中不表達，表明IRF6基因?qū)ωi消化系統(tǒng)的功能可能并不產(chǎn)生影響。

綜上實驗結(jié)果采用RT-PCR的方法對IRF6進行了基因克隆，并且以β-action基因為內(nèi)參，在豬的17種組織中研究了IRF6基因在豬不同組織中的表達規(guī)律，為進一步分析其生物學(xué)功能及其在各組織中的抑制作用奠定了基礎(chǔ)，為進一步分析IRF6基因的功能提供了理論依據(jù)。