在α-蒎烯生物環(huán)氧化反應過程中酯對反應的影響及機理探討

熊陽，覃益民，唐愛星，韋薈琳，劉幽燕，（廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004；廣西生物煉制重點實驗室，廣西 南寧 530003）

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在α-蒎烯生物環(huán)氧化反應過程中酯對反應的影響及機理探討

熊陽1，覃益民1，唐愛星1，韋薈琳1，劉幽燕1，2
（1廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004；2廣西生物煉制重點實驗室，廣西 南寧 530003）

摘要：在以過氧化脲（UHP）為氧源、Nov435為催化劑的體系中進行α-蒎烯生物環(huán)氧化反應的研究，重點考察不同酯作為?；w對反應的影響。從反應速率和酶批次穩(wěn)定性綜合考慮，以丙酸乙酯為最佳溶劑，30℃下α-蒎烯3h的環(huán)氧轉(zhuǎn)化率可達到87%左右，經(jīng)6批次反應后仍可達到47.6%，發(fā)現(xiàn)過酸和H2O2的協(xié)同作用對酶穩(wěn)定性的影響要高于單一因素。酶催化乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸戊酯、己酸乙酯等不同?；w過水解反應均可在60min達到平衡，但過酸平衡濃度和α-蒎烯化學環(huán)氧化反應速率受酯影響較大，進而對總反應化學-酶法聯(lián)合催化環(huán)氧化產(chǎn)生影響。最后探討了丙酸乙酯為唯一?；w時的反應機制，認為酶利用丙酸產(chǎn)過酸的反應速率和過酸平衡濃度遠低于酯；丙酸乙酯的水解和過水解反應為一對競爭性反應，因此有機體系更有利于環(huán)氧化反應。

關鍵詞：丙酸乙酯；α-蒎烯；環(huán)氧化反應；失活；脂肪酶；過水解；生物催化

第一作者：熊陽（1989—），男，碩士研究生。E-mail yiyuan35@aliyun. com。聯(lián)系人：覃益民，博士，教授。E-mail qym6289@sina.com。

1990年BJORKLING等[1]發(fā)現(xiàn)多種脂肪酶屬（EC 3.1.1.3，三?；视王；饷福┚哂写呋斑^水解”（perhydrolysis）反應的功能，即以有機酸和過氧化氫為底物催化合成過氧酸，這是脂肪酶催化的多功能現(xiàn)象[2-3]。化學-酶法聯(lián)合催化環(huán)氧化（chemo-enzymatic epoxidation）是此反應的一個典型應用。如圖1所示，過水解反應與環(huán)氧化反應耦合，使得過水解反應生成的過氧酸自動將活性氧原子傳遞至碳碳雙鍵生成環(huán)氧化物。與化學催化劑[4]相比，生物法具有安全、綠色工藝以及收率高等優(yōu)點[5-6]。目前人們已經(jīng)利用反應途徑開展了植物油、烯烴、氯代烴等底物[6-11]的環(huán)氧化，Novozym435是此反應中最有效的催化劑。

圖1　以脂肪酸為?；w時酶催化烯烴環(huán)氧化原理圖[1]

α-蒎烯是自然界中存在量最多的單萜烯烴之一[12]，在樟腦、冰片等化學中間體及各種合成香料、生物活性物質(zhì)制備中起著不可替代的作用。環(huán)氧化反應是其深加工的重要途徑之一，所獲的產(chǎn)物不僅本身有清涼氣息、可作為香料，還可進一步合成兩百多種香料或有生理活性的精細化學品[13]，所以條件溫和、選擇性高、副反應少的生物法更有利于此類對品質(zhì)要求較高的醫(yī)藥和香料等功能精細化學品的制備。

在化學-酶法聯(lián)合催化環(huán)氧化反應中，最初的?；w多以脂肪酸為?；w，在兩相體系中進行α-蒎烯環(huán)氧化[14-17]，雖然底物轉(zhuǎn)化完全，但由于α-蒎烯環(huán)氧化物為“酸敏感”物質(zhì)[18]，最高收率僅達到65%，酶也只能使用4批次。因此從反應穩(wěn)定性、收率等角度考慮，一些研究人員選用碳酸二甲酯等酯類作為?；w時，α-蒎烯收率可分別達到85%[19]；而XU等[10]以ε-己內(nèi)酯為溶劑可以實現(xiàn)在兩相體系中93%的收率。當以過氧化脲（能緩慢釋放H2O2）為氧源時，采用乙酸乙酯為酰基供體和溶劑，反應可獲得96%的轉(zhuǎn)化率，最高收率達95%，酶能連續(xù)使用7批次，但是酶用量較高（33mg/mL）[11]。

這些研究表明，酰基供體對α-蒎烯環(huán)氧化反應有顯著影響。首先不同酯的物性會影響H2O2在兩相間的分布，而H2O2既是反應物，又是酶的失活劑，其濃度是反應速率和穩(wěn)定性的關鍵因素；其次，酯作為過水解反應底物之一，不同酯會生成不同碳鏈長度過酸，從而可能影響過水解反應速率和α-蒎烯環(huán)氧化反應速率。一些研究者發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化體系中存在著中間產(chǎn)物——過酸[20-21]，而不同碳鏈長度的過酸對酶活的影響不同，如TORNVALL等[8]曾將酶置于0.1mol/L過十六烷酸16h后酶活仍保持99.7%，但他們也認為一些短鏈過酸如過氧乙酸對酶的毒害作用很大。

對于生物催化過程來說，要想實現(xiàn)工業(yè)化應用，需要綜合考慮反應速率、酶穩(wěn)定性及產(chǎn)物收率。為此本文選擇以過氧化脲為氧源的有機溶劑體系為反應體系，從酶穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化率兩個方面來考察酯種類對過水解反應以及α-蒎烯環(huán)氧化反應的影響，并初步探討了以丙酸乙酯為酰基供體的環(huán)氧化反應機理，從而初步解釋了丙酸乙酯體系反應活性較高的原因。

1　實驗部分

1.1不同酯類對反應的影響

分別以乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、三乙酸甘油酯、乙酸戊酯、己酸乙酯溶液為溶劑，配制α-蒎烯濃度為0.67mol/L的底物溶液。取出1.5mL底物溶液于5mL玻璃瓶中并加入過氧化脲（1.1mmoL），置于平行合成儀（智城公司，型號ZHWY-113H4F）中預熱至30℃后加入50mg Novozym435（固定化南極假絲酵母脂肪酶B，購買于美國Sigma–Aldrich）啟動反應，250r/min下反應3h后取樣氣相分析。在丙酸乙酯體系與乙酸乙酯體系中，每個批次反應3h后取樣氣相分析，脂肪酶用乙腈-水（V/V=9/1）洗去脲素，再用溶劑洗去乙腈用于下一批次反應。

量取1.5mL乙腈溶液于玻璃瓶中，并加入525mmol/L過氧化脲或60mmoL/L過氧乙酸，最后加入30mg Novozym435，30℃、250r/min搖動若干時間后取出上清液，用乙腈-水溶液（V/V=9/1）洗凈，凍干酶顆粒后用于測量酶活。定義單位時間內(nèi)酶催化丙酸乙酯過水解生成1mmoL過氧丙酸所需的酶量為一個酶活單位[22]。

1.2酯類的過水解反應與α-蒎烯環(huán)氧化反應

量取1.5mL丙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸戊酯、己酸乙酯于玻璃瓶中并加入過氧化脲（1.1mmoL），預熱至30℃后加入50mg酶，250r/min下啟動反應，并于指定時間取樣分析過酸濃度。

α-蒎烯環(huán)氧化反應：將25mL乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丁酯與6mmol過氧化脲充分混合，并加入60mg酶顆粒啟動反應（50℃、250r/min），2h后取上清液20mL置于25mL玻璃瓶中，加入α-蒎烯（164mmol/L），于30℃、40℃、50℃、60℃反應若干時間后取出樣品氣相分析。

1.3以丙酸乙酯為溶劑的酶催化過水解機制

將25mL丙酸乙酯（0.5mol/L）乙腈溶液和6.25mmol過氧化脲（UHP）充分混合，取上清液20mL（碘量法測量體系中初始H2O2濃度并計算得出H2O2摩爾數(shù)）置于25mL的玻璃瓶中，加入60mg酶顆粒啟動反應（30℃、250r/min），取樣分析過酸濃度。為了考察水對過水解反應的影響，在反應玻璃瓶中加入一定量水，使得H2O與H2O2摩爾比為1∶10，其他反應過程和條件相同，測定過酸生成量。同時設置以丙酸（0.5mol/L）為?；w的對照實驗。

1.4α-蒎烯環(huán)氧化反應轉(zhuǎn)化率、收率以及過酸濃度的測定

α-蒎烯以及其環(huán)氧化物濃度用氣相色譜（美國安捷倫公司，型號6890）測定。色譜條件：分流比為20/1，進樣口與檢測器分別設定為220℃和230℃。升溫程序：初溫100℃，以15℃/min的速率升至160℃。色譜柱為Hp-1(Agilent，30m×0.25mm×0.25μm)，正十二烷[>99.0%(GC)，Aladdin]為內(nèi)標物。

反應轉(zhuǎn)化率與收率的計算公式如式(1)、式(2)。

式中，C0為初始加入的α-蒎烯的濃度，g/L；C殘為樣品中殘留的α-蒎烯的濃度，g/L；C1為樣品中2,3-環(huán)氧蒎烷的濃度，g/L?；钚匝踉拥臐舛扔玫饬糠y量，剩余過氧化氫濃度用鈰量法測定，過酸濃度便是兩者的差值[23-24]。

2　結(jié)果與討論

2.1不同酯類對反應的影響

表1反映了不同酰基供體對環(huán)氧化反應的影響。首先不同酯的物化特性會影響H2O2在有機相中的傳質(zhì)，一般來說， lgP（P是溶劑在正丁醇與水中的分配系數(shù)，表征疏水性）值較低的溶劑中H2O2濃度較高，這有利于推動環(huán)氧化反應，如乙酸戊酯體系中H2O2濃度僅有14mmol/L，其3h的轉(zhuǎn)化率為39%；而乙酸乙酯時H2O2濃度可達到80mmol/L，轉(zhuǎn)化率可達到86%。但是過高的H2O2濃度可能造成酶的失活[25]，存在底物抑制作用。以乙酸甲酯為例，尿素過氧化氫在此系統(tǒng)中不穩(wěn)定，短時間內(nèi)釋放出大量過氧化氫，雖然有機相中H2O2濃度在反應中能保持在400mmoL/L以上，但其3h的轉(zhuǎn)化率只有44%。

表1　不同?；w對催化α-蒎烯反應的影響

其次，由于酯同時也是過水解反應底物，酯類分子結(jié)構(gòu)可能影響過水解反應，進而影響總反應速率。如在己酸乙酯中，H2O2濃度為24mmol/L，3h的轉(zhuǎn)化率為28%，而乙酸戊酯中H2O2濃度僅為14mmol/L，但其轉(zhuǎn)化率卻可達到39%。

從反應速率考慮，丙酸乙酯和乙酸乙酯作為?；w是較好的選擇。

2.2酯類對反應穩(wěn)定性的影響

進一步選擇乙酸乙酯和丙酸乙酯為溶劑，考察酶的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2所示。雖然兩種溶劑中第一批次反應的轉(zhuǎn)化率基本相同，但是在丙酸乙酯中酶批次穩(wěn)定性明顯好于乙酸乙酯：前者第七批次時的轉(zhuǎn)化率仍達到35%，而后者的轉(zhuǎn)化率只剩下4%，分析原因認為與反應中的副產(chǎn)物有關，乙酸乙酯的過水解產(chǎn)物——過氧乙酸和環(huán)氧化反應后的產(chǎn)物——乙酸，相較于丙酸乙酯來說碳鏈都更短，在相同催化時間內(nèi)對酶的毒害更大[8，26]；而且乙酸乙酯體系中H2O2濃度也更高。因此可以看出丙酸乙酯作為溶劑和?；w較為合適。在ANKUDEY 等[11]研究中，乙酸乙酯體系中Novozym 435催化烯烴環(huán)氧化連續(xù)使用6批次而沒有顯著酶活損失，可能是由于高用酶量（50mg/1.5mL）。

圖2　以丙酸乙酯、乙酸乙酯為?；w時反應穩(wěn)定性

一般認為，H2O2和過酸是環(huán)氧化體系中酶失活的主要因素[8]。為此分別研究了脲素、溶劑、α-蒎烯、H2O2和過酸等因素對酶活穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)脲素、溶劑、α-蒎烯對酶活穩(wěn)定性影響不大；但是與文獻報道不同的是，如圖3所示，本研究體系中H2O2和過氧乙酸對酶活的影響也不顯著，酶分別保存在525mmol/L H2O2和60mmol/L過氧乙酸的體系中，失活曲線基本一致，900min后仍能保持90%的活力。但是當將酶保存在過氧乙酸與H2O2共存的體系中，可以發(fā)現(xiàn)此時酶失活加劇，400min剩余酶活僅有60%，900min后僅剩余12%，這說明此環(huán)氧化體系中酶的失活可能是過酸與H2O2的協(xié)同作用，這有待于進一步研究。

圖3　過酸與H2O2對酶活的影響

2.3不同?；w對酶催化產(chǎn)過酸以及α-蒎烯環(huán)氧化反應的影響

為探究不同酯類如何影響過水解反應以及Chemical epoxidation反應速率進而控制整個Chemo-enzymatic epoxidation反應，首先測定其過水解速率，如圖4所示。

圖4　酶催化不同酯過水解

以4種酯為?；w的過水解反應幾乎均在60min后達到平衡；反應初期，酶催化乙酸乙酯過水解速率最大，丙酸乙酯次之，乙酸戊酯稍大于己酸乙酯，其過酸平衡濃度依次遞減，分別為434mmol/L、234mmol/L、101mmol/L和82mmol/L。可以發(fā)現(xiàn)，過水解反應與表1中環(huán)氧化反應結(jié)果并不嚴格對應，雖然以丙酸乙酯和乙酸乙酯為底物的生成過酸平衡濃度相差兩倍（其H2O2濃度基本相同），但是α-蒎烯總環(huán)氧化速率在這兩種溶劑中相近；而己酸乙酯過水解速率稍小于乙酸戊酯，其環(huán)氧化速率也較小。這是由于α-蒎烯化學環(huán)氧化反應也影響著總環(huán)氧化速率。為此，測定以乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丁酯為酰基供體時的環(huán)氧化反應進程，如圖5所示，環(huán)氧化速率都隨溫度升高而增大，如丙酸乙酯體系中30℃時120min轉(zhuǎn)化率為63%，60℃轉(zhuǎn)化率增至72%。在同一溫度下，乙酸乙酯體系中α-蒎烯轉(zhuǎn)化較快，50℃時反應30min乙酸乙酯體系中轉(zhuǎn)化率達到59%，而丙酸乙酯體系與乙酸丁酯體系中轉(zhuǎn)化率為46%、51%，3種體系中反應速率差別不大，可能是由于過酸初始濃度不同所致。

圖5　不同溫度下丙酸乙酯體系、乙酸乙酯體系、乙酸丁酯體系中蒎烯烴反應速率

因此，以速率常數(shù)來表征不同酯對反應速率的影響更為理想。根據(jù)文獻報道[21]，蒎烯chemical epoxidation反應符合二級動力學，擬合方程為式(3)。

式中，M=[Q]]/[PO]；[PO]為α-蒎烯初始濃度；QO為過酸初始濃度；XC為α-蒎烯轉(zhuǎn)化率。

圖6　不同酯體系中蒎烯環(huán)氧化反應擬合曲線

通過圖6與擬合方程可得出不同溫度下化學環(huán)氧化反應速率常數(shù)，如表2所示。

表2　不同酯體系蒎烯環(huán)氧化反應速率常數(shù)

3種體系中速率常數(shù)都隨溫度升高而變大。而同一溫度下不同酯體系中蒎烯化學環(huán)氧化反應速率不同，首先是由于不同碳鏈長度過氧酸與烯烴反應時由于其質(zhì)子化狀態(tài)不同而速率相異[27]，如表2中丙酸乙酯體系環(huán)氧化常數(shù)大于乙酸乙酯體系，這與前述丙酸乙酯體系過水解速率較小而兩種酰基供體體系總環(huán)氧化速率相同的結(jié)果對應；其次，表2中乙酸乙酯體系與乙酸丁酯體系中反應物都為過氧乙酸，但乙酸乙酯體系速中率常數(shù)較大，應該是由溶劑效應引起的，即溶劑自身溶解底物的特性。

2.4以丙酸乙酯為溶劑的酶催化過水解反應機制

過水解反應一般被認為是環(huán)氧化過程的限速步驟，探究丙酸乙酯體系中酶催化機制有助于了解整個環(huán)氧化過程。

圖7反映了在有機體系中以酸或酯為?；w以及外加水量對酶催化過水解效率的影響?？梢钥闯?，在無外加水的環(huán)境中丙酸乙酯過水解反應速率最大，在180min內(nèi)過酸可達到59.2mmol/L的平衡濃度；而以丙酸為?；w的過水解反應無論是反應速率還是生成的過酸平衡濃度均比以丙酸乙酯為低，過酸平衡濃度只有7.5mmol/L，這說明了在有機體系中以酯為?；w要優(yōu)于丙酸。由此可見，當選用丙酸乙酯作為?；w與溶劑時，作為過水解產(chǎn)物之一的丙酸基本不能被酶利用再生成過酸。

圖7　?；w與H2O對產(chǎn)過酸的影響

當外加水量為240mmol/L時，過丙酸平衡濃度下降至48.7mmol/L，而當c(H2O)=10c(H2O2)= 2400mmol/L時，平衡濃度下降至32.2mmol/L，進一步考察上述體系中丙酸乙酯的消耗，當加入的H2O從0增至2400mmol/L時，丙酸乙酯轉(zhuǎn)化率由30%增至88%，表明當體系中同時存在H2O和H2O2時，酯的水解和過水解反應同時進行，是一對競爭性反應，其次，酯的水解部分由于生成的丙酸不能再次轉(zhuǎn)化為過酸而“無效率”，因而外加水會降低過酸平衡濃度。故以丙酸乙酯作為?；w時，有機環(huán)境可以減少水解反應的發(fā)生，因此更適合于環(huán)氧化反應。需要指出的是，各個體系中總的活性氧原子濃度（240mmol/L左右，即過酸與剩余過氧化氫濃度之和）在反應過程中都基本不變，這說明生成的過酸和過氧化氫在體系中能保持穩(wěn)定。

這與XU等[10]以己內(nèi)酯為溶劑和酰基供體的環(huán)氧化反應機制不同：當H2O和H2O2同時存在于有機相時，作為產(chǎn)物之一的6-羥基己酸仍可作為酰基供體在酶催化作用下生成過酸，而且其過水解速率是酯的60倍。

3　結(jié) 論

對于α-蒎烯的環(huán)氧化過程，以酯作為溶劑與過水解底物、采用過氧化脲為氧源的有機體系可以獲得較高的收率。以反應速率和酶批次穩(wěn)定性兩個指標來優(yōu)化酯的種類、溫度等因素，發(fā)現(xiàn)丙酸乙酯或乙酸乙酯中可以獲得最佳的環(huán)氧化反應轉(zhuǎn)化率，批次使用穩(wěn)定性則以丙酸乙酯為佳；反應轉(zhuǎn)化率和收率在30℃和40℃之間沒有明顯差別，但30℃時酶可以獲得更好的穩(wěn)定性。在最優(yōu)條件下采用30mg/L的酶量下3h的環(huán)氧轉(zhuǎn)化率為87%，6批次反應后仍能達到47.6%。對反應機制的研究顯示，酯的不同會顯著影響有機相中H2O2的濃度、過酸平衡濃度等，進而影響總環(huán)氧化反應速率；在丙酸乙酯體系中酶只能以酯為?；w產(chǎn)過酸，丙酸基本不能再被利用，而且丙酸乙酯的水解反應和過水解反應為競爭性反應，因此有機體系更有利于反應。

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綜述與專論

Chemo-enzymatic epoxidation of α-pinene：ester as influencing factors and mechanism of the reaction

XIONG Yang1，QIN Yimin2，TANG Aixing1，WEI Huilin1，LIU Youyan1，2
（1College of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，Guangxi，China;2Guangxi Key Laboratory of Biorefinery，Nanning 530003，Guangxi，China）

Abstract：Chemo-enzymatic epoxidation of α-pinene was achieved in a non-aqueous system which employed esters as solvent and perhydrolysis substrate，urea-hydrogen peroxide (UHP) as an oxygen source and lipase as catalyst. Different esters were found to affect the reaction significantly. The optimal reaction condition was 30℃ and ethyl propionate as the solvent considering both the reaction rate and the stability of enzyme. Under these conditions，the conversion could achieve 87% after 3h and remain 47.6% after 6 cycles. The synergy toxic effect of H2O2and peracid was more significant than that of single one. It was found that using different acyl donors such as ethyl acetate，ethyl propionate，amyl acetate，ethyl caproate and the like，the reaction of lipase-catalyzed production of peracid can all reach equilibrium within 60min. However，the equilibrium concentration of peracid and the rate of chemical epoxidation greatly depended on the ester employed，which in turn affected the overall epoxidation of α-pinene. The mechanism of the reaction with ethyl propionate as the exclusive acyl donor was discussed. The reaction rate and the equilibrium concentration for producing peracid by enzyme with propionic acid was significantly lower than those with esters and it was found that there are competitions between the enzymatic hydrolysis with H2O and the perhydrolysis with H2O2whenbook=221,ebook=228H2O existed，and therefore the nonaqueous environment was more suitable for the epoxidation.

Key words：ethyl propionate; α-pinene; epoxidation; deactivation; lipase; perhydrolysis; biocatalysis

基金項目：國家自然科學基金（21276053）及廣西自然科學基金（0991001）項目。

收稿日期：2015-04-28；修改稿日期：2015-06-30。

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.01.030

中圖分類號：Q 503

文獻標志碼：A

文章編號：1000–6613（2016）01–0220–07