長鏈非編碼RNA與腫瘤關(guān)系研究進(jìn)展

高熒苒，王大勇，李 濤，姬新穎

河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004

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長鏈非編碼RNA與腫瘤關(guān)系研究進(jìn)展

河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度在200～10 000 nt之間的不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，具有保守性低、組織特異性表達(dá)的特點。它參與細(xì)胞內(nèi)多種過程的調(diào)控，對于哺乳動物的基因組和轉(zhuǎn)錄組以及轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控有著重要的影響。許多研究表明，lncRNA在許多不同類型的腫瘤中表達(dá)異常，探討lncRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，可以使lncRNA成為腫瘤診斷的新的生物標(biāo)志物和腫瘤治療的潛在靶點。本文主要對lncRNA與食管癌關(guān)系的研究進(jìn)行綜述。

長鏈非編碼RNA；腫瘤；食管癌；基因調(diào)控

長鏈非編碼RNA(lncRNA)的表達(dá)異常與許多疾病密切相關(guān)，如認(rèn)知障礙、心血管疾病、糖尿病和腫瘤等。lncRNA在多種類型的腫瘤中表達(dá)異常，它們的異常表達(dá)可能促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生，如已經(jīng)證實lncRNA在乳腺癌、肝癌、膀胱癌等腫瘤中異常表達(dá)。

然而關(guān)于lncRNA與食管癌的關(guān)系研究較少，本文對lncRNA與腫瘤的關(guān)系以及l(fā)ncRNA在食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　乳腺癌與lncRNA

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種lncRNA與乳腺癌密切相關(guān)，如NBAT1、CCAT2、MALAT1等。

Hu[1]等基于癌癥和腫瘤基因圖譜(TCGA)，通過分析lncRNA數(shù)據(jù)庫中NBAT1在lncRNA表達(dá)中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常的組織相比，在癌組織中NBAT1表達(dá)被抑制，而且Kaplan-meier 生存分析表明NBAT1的低表達(dá)與不良的生存預(yù)后有關(guān)。為研究NBAT1在乳腺癌中的表達(dá)，比較乳腺上皮非致瘤性細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系中NBAT1不同入侵性的表達(dá)，相比乳腺上皮細(xì)胞系，在乳腺癌細(xì)胞中NBAT1的表達(dá)是下調(diào)的，而且NBAT1的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞系的入侵能力呈負(fù)相關(guān)，遷移能力較高的細(xì)胞株MDA-MB-231、MDA-MB-436、BT-549相對遷移能力較低的細(xì)胞株MCF7、T-470、ZR-75-1、BT-474、SK-BR-3、MDA-MB-453，NBAT1顯著低表達(dá)。為了進(jìn)一步研究NBAT1抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和入侵的機(jī)制，通過微陣列分析來探討NBAT1過表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞系全基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)NBAT1經(jīng)由EZH2途徑通過激活DKK1表達(dá)來抑制乳腺癌的遷移和入侵。這表明長鏈非編碼RNA NBAT1是一個潛在的腫瘤抑制基因，是判斷乳腺癌預(yù)后的一個潛在標(biāo)記，也是抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的一個潛在靶點。

Cai[2]等在最近的研究中首先通過實時定量PCR，測定67對食管癌組織與相鄰正常組織中CCAT2的表達(dá)，證實在乳腺癌組織中CCAT2高表達(dá)，同樣在食管癌細(xì)胞中CCAT2也高表達(dá)。進(jìn)一步分析CCAT2表達(dá)和臨床預(yù)后因素之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CCAT2高表達(dá)的患者預(yù)后明顯較差，而且CCAT2相對表達(dá)水平與乳腺癌患者總體生存率相關(guān)。為了探索CCAT2在乳腺癌細(xì)胞中的生物功能，將CCAT2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系，通過MTT實驗、transwell實驗等發(fā)現(xiàn)抑制CCAT2的表達(dá)可以抑制體外乳腺癌細(xì)胞的增殖和入侵。然后，為了探索CCAT2在腫瘤發(fā)生中的作用，將轉(zhuǎn)染NS質(zhì)粒或CCAT2質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞系混合基底膜基質(zhì)注入裸鼠體內(nèi)，兩周后可以觀察到明顯的腫瘤，表明抑制CCAT2的表達(dá)可以抑制體內(nèi)腫瘤的形成。最后還發(fā)現(xiàn)，CCAT2的異常表達(dá)會影響Wnt信號通路。因此，認(rèn)為lncRNA CCAT2可能是一種參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的新的分子，它為乳腺癌提供了一個潛在的治療靶點。

最近的研究表明，MALAT1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。為了探索它在乳腺癌中是否也有類似的作用，Xu[3]等通過qPCR測定臨床樣本中MALAT1的表達(dá)，從乳腺癌患者中隨機(jī)抽出的135個樣本，發(fā)現(xiàn)相對于鄰近的正常組織，乳腺癌組織中MALAT1表達(dá)下調(diào)，且乳腺癌細(xì)胞中MALAT1表達(dá)也下調(diào)。為了進(jìn)一步研究MALAT1表達(dá)與乳腺癌特征之間的關(guān)系，在檢測135個乳腺癌患者臨床病理參數(shù)時檢測MALAT1表達(dá)。統(tǒng)計分析表明，MALAT1表達(dá)下調(diào)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系，生存分析表明MALAT1表達(dá)下調(diào)的乳腺癌患者生存率較低，即MALAT1在乳腺癌患者中的低表達(dá)與低的生存率有關(guān)。而且發(fā)現(xiàn)MALAT1表達(dá)下調(diào)，會促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和入侵，乳腺癌細(xì)胞中的MALAT1下調(diào)可以通過磷脂酰肌醇-3-激酶信號通路誘導(dǎo)EMT進(jìn)程。因此，考慮到MALAT1下調(diào)的乳腺癌患者的不良預(yù)后，發(fā)現(xiàn)MALAT1作為乳腺癌中EMT的調(diào)控因素，可能是有效治療乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在目標(biāo)。

2　膀胱癌與lncRNA

一些lncRNA在膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Xue[4]等為了研究lncRNA-UCA1是否通過誘導(dǎo)EMT來調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞的遷移和入侵，首先建立了在食管癌UMUC2細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1或pcDNA 3.1-UCA1質(zhì)粒后，能穩(wěn)定表達(dá)lncRNA-UCA1的模型，并通過實時定量PCR證實了lncRNA-UCA1的異常過表達(dá)；然后觀察轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1或pcDNA 3.1-UCA1質(zhì)粒的UMUC2細(xì)胞系的表型變化，又經(jīng)過免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA-UCA1過表達(dá)可以減少細(xì)胞膜上鈣粘蛋白的表達(dá)，并增加波形蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，lncRNA-UCA1在膀胱癌細(xì)胞中發(fā)揮了誘導(dǎo)EMT的作用。與對照組相比，UMUC2細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA-UCA1的過表達(dá)可以增加細(xì)胞的流動性，降低入侵的可能。這表明lncRNA-UCA1在調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞的遷移和入侵中起著重要的作用，lncRNA-UCA1通過hsa-miR-145-FSCN1通路調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞的遷移和入侵，lncRNA-UCA1和hsa-miR-145的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。因此，lncRNA-UCA1可能作為一種很有前途的目標(biāo)來治療膀胱癌的入侵和轉(zhuǎn)移。

研究證實，GAS5可以控制細(xì)胞凋亡，而它在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)。Liu[5]等為了研究GAS5是否參與調(diào)節(jié)膀胱腫瘤的發(fā)生，首先檢測了膀胱癌組織與鄰近正常組織的GAS5的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細(xì)胞和組織中GAS5的表達(dá)普遍下調(diào)，而且下調(diào)膀胱癌中GAS5的表達(dá)會導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞的增殖；又通過蛋白質(zhì)體外結(jié)合實驗、RNA免疫共沉淀實驗等發(fā)現(xiàn)GAS5能夠通過CDK6調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞周期，敲除GAS5可以增加膀胱癌細(xì)胞中CDK6在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，GAS5下調(diào)導(dǎo)致G0/G1期細(xì)胞顯著降低，S期細(xì)胞顯著增加。通過功能的獲得和喪失實驗表明，在某種程度上，GAS5通過調(diào)節(jié)CDK6的表達(dá)來抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。

Chen[6]等在最近的研究中，首先采用層次聚類分析，比較膀胱癌組織和鄰近正常組織中l(wèi)ncRNA的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)有3種lncRNA在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào)，35種表達(dá)下調(diào)，其中l(wèi)ncRNA-n336928上調(diào)最顯著，因此集中研究lncRNA-n336928；隨后，用實時定量PCR測定了95例膀胱癌患者的組織樣本以及鄰近的非病變組織。結(jié)果表明，與相鄰的非癌變組織相比，在膀胱癌組織中l(wèi)ncRNA-n336928的表達(dá)水平明顯升高。隨后又研究了lncRNA-n336928表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，經(jīng)卡方檢驗，lncRNA-n336928表達(dá)與腫瘤階段和等級呈正相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析表明，lncRNA-n336928高表達(dá)的膀胱癌患者的總體存活率低于lncRNA-n336928低表達(dá)的患者。因此，lncRNA-n336928可能作為膀胱癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。

Han[7]等采用實時定量PCR測定了27位膀胱泌尿上皮腫瘤患者的腫瘤組織與鄰近正常組織中hsa-miR-125b、SIRT7和MALAT1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在膀胱癌組織中hsa-miR-125b表達(dá)下調(diào)，SIRT7和MALAT1的表達(dá)上調(diào)。分析發(fā)現(xiàn)，與腫瘤發(fā)生的低級階段相比，高級階段的SIRT7和MALAT1的表達(dá)水平較高，hsa-miR-125b表達(dá)水平較低，而且hsa-miR-125b調(diào)控SIRT7和MALAT1的表達(dá)。經(jīng)計算機(jī)模擬分析，發(fā)現(xiàn)SIRT7和lncRNA-MALAT1可以作為預(yù)測hsa-miR-125b的目標(biāo)。SIRT7是哺乳動物去乙酰化組蛋白家族的成員，在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，MALAT1在很多癌癥中也是過表達(dá)，之前確定MALAT1在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)，扮演了致癌角色。因此，hsa-miR-125b通過下調(diào)致癌基因SIRT7和致癌性lncRNA-MALAT1的表達(dá)來抑制膀胱癌的發(fā)展。

3　食管癌與lncRNA

食管癌作為世界上第八位最常見癌癥，在全部惡性腫瘤死亡回顧調(diào)查中僅次于胃癌而居第二位?，F(xiàn)在主要的治療方法有手術(shù)、放療或化療，但是治療水平和預(yù)后依然很差。早期的診斷是關(guān)鍵，但是由于食管癌早期缺乏典型的癥狀和足夠靈敏特定的生物標(biāo)志物，所以很難在早期診斷出來。因此，需要尋找在食管癌發(fā)生早期的生物標(biāo)志物，來降低食管癌的死亡率。最近的研究顯示，lncRNA在食管癌的發(fā)生中扮演重要的角色，對這些lncRNA進(jìn)行干預(yù)會成為食管癌早期診斷和治療的靶點。

Xu[8]等對62例食管癌患者運用實時定量PCR分析，將食管癌組織與鄰近正常組織相比，發(fā)現(xiàn)TUG1高表達(dá)，平均高4.84倍；然后探討TUG1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TUG1的表達(dá)與家族史密切相關(guān)。為了研究TUG1的生物學(xué)功能，在體外設(shè)計了兩種SiRNA來抑制TUG1，向兩種高表達(dá)TUG1的TE-13和KYSE-410細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染si-TUG1或NC，經(jīng)36 h培養(yǎng)，TUG1表達(dá)顯著下降。CCK8檢測表明敲除TUG1可以顯著抑制TE-13和KYSE-410細(xì)胞系的增殖。接下來的細(xì)胞流式分析則進(jìn)一步驗證TUG1是否可以通過改變細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡過程來影響食管癌細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示SiRNA可以阻滯TE-13和KYSE-410的S期，但沉默TUG1并不影響細(xì)胞凋亡。細(xì)胞劃痕實驗顯示下調(diào)TUG1顯著降低TE-13和KYSE-410細(xì)胞系的遷移能力。而且transwell實驗表明與正常對照相比，SiRNA可以顯著降低遷移能力。可知，TUG1促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖和遷移，是一個潛在的致癌基因。

Wang[9]等通過qRT-PCR測量73對食管癌患者病變組織與臨近正常組織中PlncRNA-1的表達(dá)。結(jié)果表明，在69.8%的食管癌患者的癌變組織中PlncRNA-1的表達(dá)顯著上調(diào)，PlncRNA-1表達(dá)的平均值為7.562。依據(jù)平均值把食管癌患者分為兩組：一組的PlncRNA-1表達(dá)率小于平均值，一組的PlncRNA-1表達(dá)率大于平均值。然后，分析食管癌患者的臨床病理信息與PlncRNA-1表達(dá)之間的關(guān)系，與腫瘤僅在食管局部相比，腫瘤擴(kuò)散到淋巴結(jié)的PlncRNA-1的表達(dá)顯著提高，而且臨床病理階段III、IV期的PlncRNA-1的表達(dá)明顯高于I、II期。為了研究PlncRNA-1在食管癌中的作用，采用實時定量PCR測量7種食管癌細(xì)胞系和1個良性食管上皮細(xì)胞系中PlncRNA-1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)7種癌細(xì)胞系中PlncRNA-1的表達(dá)均高于Het1A細(xì)胞系，其中KYSE180中PlncRNA-1表達(dá)最高。所以，將KYSE180細(xì)胞系用于接下來的研究，通過平板克隆實驗發(fā)現(xiàn)敲除KYSE180細(xì)胞系的PlncRNA-1細(xì)胞增殖明顯受到抑制，因此下調(diào)PlncRNA-1的表達(dá)可以抑制食管癌細(xì)胞的增殖。

Tong[10]等首先篩選出GAPDH作為分析食管癌組織中l(wèi)ncRNA的最佳內(nèi)參，測定了270例血漿樣本中GAPDH的表達(dá)。結(jié)果顯示，GAPDH的水平穩(wěn)定，不受年齡、性別和病變的影響。然后，通過實時定量PCR檢測48對食管癌組織和鄰近正常組織中10種lncRNA的表達(dá)，包括HOTAIR、AFAP1-AS1、POU3F3、HNF1A-AS1、PlncRNA1、SPRY4-IT1、ENST00000435885.1、ENST00000547963.1、91H 和XLOC_013104。結(jié)果表明，除91H 和XLOC_013104外，其余l(xiāng)ncRNA均在食管癌組織中表達(dá)顯著提高。為了探討這些與食管癌相關(guān)的lncRNA是否進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)可以被檢測到，采用實時定量PCR檢測48個血漿樣本中這8種lncRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，POU3F3、HNF1A-AS1、SPRY4-IT1在食管癌患者中的表達(dá)顯著高于正常對照組。為了進(jìn)一步確定這些lncRNA是否存在于血漿中，將qPCR產(chǎn)物采用傳統(tǒng)的Sanger測序法測序，如預(yù)期一樣，測得的序列與從POU3F3、HNF1A-AS1、SPRY4-IT1中得到的相同。接下來，又檢測了這三種與食管癌相關(guān)的lncRNA在血漿中存在的穩(wěn)定性，比較了血漿和血清中l(wèi)ncRNA的表達(dá)，結(jié)果表明評估血漿和血清中的lncRNA的表達(dá)都可以作為腫瘤生物標(biāo)志物。為了進(jìn)一步確定食管癌患者血漿中這三種lncRNA表達(dá)水平是否與臨床病理參數(shù)有關(guān)，測量147例食管癌患者的POU3F3、HNF1A-AS1、SPRY4-IT1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)血漿中這三種lncRNA表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)沒有明顯關(guān)系。147例食管癌患者和123名健康者的ROC曲線以及AUC顯示，在食管癌患者和健康人群中ROC曲線明顯不同，POU3F3的AUC為0.842，HNF1A-AS1的為0.781，SPRY4-IT1的為0.800，與標(biāo)準(zhǔn)的腫瘤標(biāo)志SCCA的AUC 0.784相比，血漿中POU3F3的表達(dá)水平可以將食管癌與正常對照組區(qū)分開來。

Wang[11]等為了驗證MALAT1是否受miRNA的調(diào)控，首先敲除Ago2和內(nèi)切酶來測量食管癌細(xì)胞中MALAT1表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)KYSE30、KYSE150和KYSE450細(xì)胞系中MALAT1的表達(dá)升高了1.2～1.5倍。結(jié)果表明，miRNA參與了MALAT1的調(diào)控。而且發(fā)現(xiàn)miR-101和miR-217都呈時間和濃度依賴性抑制細(xì)胞增殖，證實了MALAT1的轉(zhuǎn)錄后沉默是通過miR-101和miR-217阻滯G2/M細(xì)胞周期來抑制食管癌細(xì)胞的增殖。還發(fā)現(xiàn)通過過表達(dá)miR-101、miR-217或MALAT1siRNA可以抑制食管癌細(xì)胞的遷移和入侵能力，這可能是由于MALAT1下游基因的異常表達(dá)，如MIA2、HNF4G、ROBO1、CCT4和CTHRC1。通過比較42對食管癌組織樣本和鄰近正常組織，發(fā)現(xiàn)miR-101或miR-217與MALAT1存在顯著的負(fù)相關(guān)。異種移植小鼠實驗數(shù)據(jù)也證實miR-101和miR-217在食管癌中的腫瘤抑制作用。因此說明，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中，miRNAs與lncRNA是相互作用的，了解lncRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，可能成為惡性腫瘤診斷、預(yù)后判斷的新的分子標(biāo)記以及改善腫瘤治療效果的分子靶標(biāo)。

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[責(zé)任編輯李麥產(chǎn)]

Research progress on the relationship between lncRNA and tumor

College of Medicine, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

Long chain non coding RNA (lncRNA) is a RNA molecule that does not encode protein between the length of 200-10000nt. It has the characteristics of low conservation and tissue specific expression. It participates in the regulation of many processes in the cell, and lncRNA has important influence on the regulation of the mammalian genome and transcription group, as well as the regulation of gene expression after transcription and transcription. Many studies show that lncRNA in many different types of tumors is the abnormal expression, and to investigate the relationship between the lncRNA and tumor development can make the lncrna marks a potential target and tumor therapy for tumor diagnosis of new biological. In this paper, the research on the relationship between lncRNA and esophageal cancer is reviewed.

long chain non coding RNA; tumor; esophageal cancer; gene regulation

1672-7606(2016)03-0221-04

2016-05-28

國家自然科學(xué)基金面上項目(81470545，81670088)

高熒苒(1992-)，女，河南安陽人，在讀研究生，從事精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)免疫學(xué)研究工作。

姬新穎(1963-)，男，河南新安人，河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授，從事細(xì)胞免疫研究與治療工作。

R730

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