復方丹參注射液對兔壓迫性頸髓損傷減壓術后療效影響的實驗研究

邊振宇 王 磊 李茂強 王雪鵬 朱六龍

復方丹參注射液對兔壓迫性頸髓損傷減壓術后療效影響的實驗研究

邊振宇 王 磊 李茂強 王雪鵬 朱六龍

目的探討復方丹參注射液對壓迫性頸髓損傷減壓后繼發(fā)性缺血再灌注損傷干預作用。方法雄性新西蘭白兔24只，隨機分為壓迫組、復方丹參+減壓組、減壓組和正常對照組，每組6只。除正常對照組外，余三組建立兔頸髓壓迫損傷動物模型。復方丹參+減壓組在減壓術前及術后給予靜脈注射復方丹參注射液2g/（kg·d），壓迫組與減壓組給予等體積生理鹽水，正常對照組動物不進行手術操作。觀察兔后肢并進行運動功能評分、頸髓組織學檢查、細胞凋亡及免疫組化檢查。結果減壓第1、28天時復方丹參+減壓組兔后肢運動功能評分分別為（5.33±0.58）分及（6.00±0.00）分，均顯著大于減壓組（3.67±0.58）分及（5.00±0.00）分（P＜0.05）。組織學檢查顯示，復方丹參+減壓組兔頸髓神經元水腫及神經膠質細胞增生較減壓組輕。兔頸髓組織免疫組化檢測顯示在第28天時，復方丹參+減壓組血管數(shù)（12.33±2.12），顯著多于壓迫組的（5.67±2.50）（P＜0.05），及減壓組（9.78± 2.17）（P＜0.05）。細胞凋亡檢測顯示減壓術后第1、28天，復方丹參+減壓組頸髓組織凋亡指數(shù)分別為（0.89±0.33）及（0.56±0.53），顯著小于壓迫組的（2.22±1.56）及（4.00±2.12）（P＜0.05），減壓組的（1.78±0.67）及（1.67±0.50）（P＜0.05），與正常對照組（0.78±0.44）及（0.56±0.53）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論復方丹參注射液可改善壓迫性頸髓損傷兔減壓術后脊髓的微循環(huán)，減輕減壓術后缺血再灌注損傷，增強減壓術的療效，促進術后運動功能的恢復。

兔；壓迫性頸髓損傷；減壓術；缺血再灌注損傷；復方丹參注射液

壓迫性脊髓損傷（compressive spinal cord injury）在臨床上十分常見，脊髓型頸椎病是壓迫性脊髓損傷最常見的病因之一[1-2]。目前臨床上無論是采取外科手術脊髓減壓還是營養(yǎng)神經的藥物治療效果都不確切。研究發(fā)現(xiàn)，局部缺血和再灌注損傷在神經變性的過程中起了非常重要的作用[3]。中醫(yī)認為，脊髓損傷為傷及督脈[4]，復方丹參注射液具有活血化瘀，通經活絡的作用。本文采用兔頸髓壓迫性損傷模型，在減壓術前及術后給予復方丹參注射液靜脈注射，探討其對頸髓損傷減壓術后的缺血再灌注損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性新西蘭白兔24只，體質量2.5～3.0kg，購自浙江省農業(yè)科學院，許可證號：SCXK（浙）2010-0047。飼養(yǎng)于杭州師范大學清潔級實驗動物飼養(yǎng)中心。

1.2 主要試劑 戊巴比妥鈉（Sigma，批號120505），復方丹參注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號1301213），TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（ROCHE，貨號11684817910），蛋白酶K（Tiangen）。

1.3 主要儀器 柔性顱骨鉆（淮北正華生物儀器設備有限公司，ZH-RX2型），顯微鏡（BH2型，OLYMPUS公司）。

1.4 實驗方法 24只大白兔隨機分為壓迫組、復方丹參處理+減壓組、減壓組及正常對照組，每組6只。除正常對照組外，余三組建立壓迫性頸髓損傷模型：采用3%戊巴比妥鈉30mg/kg耳緣靜脈麻醉動物，頸部消毒，于頸5/6前正中入路，椎間作一直徑4mm圓孔，在鉆頭即將到達硬膜外腔隙時注意控制鉆入速度與力度，并及時取出骨屑，直至鉆頭到達椎管內硬膜外腔隙。攻入無菌塑料螺栓，隔硬脊膜壓迫脊髓，螺釘長度由預實驗確定，使脊髓受壓約35%，閉合切口。壓迫15天后行減壓術，旋出螺栓并清除突入椎管的椎間盤等組織，嚴密止血。復方丹參處理+減壓組于減壓術前30min靜脈注射復方丹參注射液1次，術后連續(xù)靜脈注射給藥7天，劑量為2g/（kg·d）。壓迫組與減壓組給予等體積生理鹽水，正常對照組動物不進行手術操作。

1.5 三組白兔后肢運動功能評分 各組在減壓后1天和28天各取3只白兔，在處死前進行改良Tarlov評分[5]對動物后肢功能進行評分。評分標準為：0分：完全癱瘓，針刺時下肢無反應；1分：完全癱瘓，針刺時下肢有反應，但肢體不能活動；2分：肢體可活動，但不能站立或站立不穩(wěn)（＜5s）；3分：可站立，但無法行走；4分：可行走數(shù)步，但不穩(wěn)定；5分：能緩慢行走，但不靈活，存在一定缺陷；6分：正常行走。

1.6 檢測指標 各組在減壓后第1、第28天各處死3只動物，進行指標檢測。

1.6.1 組織學檢查 處死動物后采用組織學方法對受壓部位頸髓組織進行HE染色切片檢查。

1.6.2 細胞凋亡檢測（TUNEL法） 石蠟包埋組織4μm切片，采用TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒，具體流程如下：組織切片常規(guī)脫蠟后，滴加20μg/mL蛋白酶K，PBS漂洗3次。加50μL TUNEL反應混合液（每片用5μl TdT+45μL熒光素標記的dUTP液混勻，即1：9的比例）于標本上，PBS漂洗3次，玻片干后加50μL converter-POD于標本上，PBS漂洗，在組織處加適量DAB底物，顯微鏡下控制顯色；PBS終止顯色；再用蘇木素復染后封片。顯微鏡觀察照相。同時做TUNEL法染色對照試驗，TUNEL反應液中不加TdT酶。凋亡細胞在原位末端標記后呈特異的棕褐色，稱為陽性細胞。計數(shù)灰質和白質中膠質細胞的陽性細胞數(shù)目。在高倍鏡（×200倍）下隨機觀察3個視野。

1.6.3 免疫組化 石蠟包埋組織4μm切片，常規(guī)二甲苯脫蠟。采用兔CD31免疫組化試劑盒，按說明書的步驟進行操作。3%過氧化氫溶液封閉約10min，PBS液沖洗3次，每次3min，正常羊血清工作液37℃封閉30min，傾去工作液，滴加一抗4℃孵育過夜（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照），PBS液沖洗3次，每次3min，滴加二抗，37℃孵育15min，PBS液沖洗3次，每次3min，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶，37℃孵育15min，DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水，樹膠封片。陽性細胞呈棕黃色至褐色。在高倍鏡（×200倍）下隨機觀察3個視野，計數(shù)脊髓內陽性血管數(shù)目。

2 結果

2.1 各組兔后肢運動功能評分比較 減壓第1天，復方丹參+減壓組及正常對照組兔后肢運動功能評分均顯著大于壓迫組（P＜0.05），復方丹參+減壓組評分顯著大于減壓組（P＜0.05）；減壓第28天，復方丹參+減壓組、減壓組及正常對照組兔后肢運動功能評分均大于壓迫組（P＜0.05），復方丹參+減壓組評分顯著大于減壓組（P＜0.05），見表1。

表1 四組兔后肢運動功能評分比較（分±s）

表1 四組兔后肢運動功能評分比較（分±s）

注：與壓迫組比較，*P＜0.05；與減壓組比較，△P＜0.05

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2.2 HE染色結果 壓迫組：1天時見脊髓白質區(qū)呈疏松網狀，并見脫髓鞘，白質和灰質區(qū)局部可見神經元及神經纖維變性、壞死，壞死周邊有組織水腫。28天時灰質區(qū)神經膠質細胞增生明顯，神經元細胞減少，仍見脫髓鞘，神經元變性、壞死等病變。復方丹參+減壓組：1天時神經膠質細胞增生較減壓組減輕，但仍可見個別神經元變性。28天時組織未見明顯病變。減壓組：1天時見個別神經元變性，膠質細胞增生無明顯差異；28天時無明顯神經元變性，膠質細胞增生減弱，但巨噬細胞數(shù)量增多。正常對照組：脊髓灰質區(qū)神經元細胞大而多角，核圓居中，核膜明顯，染色質呈細顆粒狀，核仁明顯，胞漿豐富且尼氏小體清晰可見；白質區(qū)神經纖維排列緊密整齊，軸突髓鞘結構清晰勻稱。（封三圖1）。

2.3 細胞凋亡檢測（TUNEL法） 第1天時，復方丹參+減壓組及正常對照組兔頸髓組織凋亡指數(shù)顯著小于壓迫組（P＜0.05），減壓組凋亡指數(shù)與壓迫組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），復方丹參+減壓組凋亡指數(shù)顯著小于減壓組（P＜0.05）。第28天時，復方丹參+減壓組、正常對照組及減壓組凋亡指數(shù)均顯著小于壓迫組（P均＜0.05），復方丹參+減壓組凋亡指數(shù)顯著小于減壓組（P＜0.05），與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2和封三圖2。

表2 四組兔脊髓細胞凋亡指數(shù)比較（±s）

表2 四組兔脊髓細胞凋亡指數(shù)比較（±s）

注：與壓迫組比較，*P＜0.05；與減壓組比較，△P＜0.05

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2.4 免疫組化 CD31免疫陽性主要定位在血管內皮，呈棕黃色至褐色。第28天時，復方丹參+減壓組、減壓組兔脊髓組織CD31表達血管數(shù)顯著多于壓迫組（P＜0.05）；復方丹參+減壓組顯著多于減壓組（P＜0.05），見表3。

表3 四組兔脊髓組織CD31表達血管數(shù)比較（±s）

表3 四組兔脊髓組織CD31表達血管數(shù)比較（±s）

注：與壓迫組比較，*P＜0.05；與減壓組比較，△P＜0.05

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3 討論

由機械壓迫導致的脊髓損傷是脊柱外科常見疾病，手術常被認為是有效的治療手段。由于減壓前受壓脊髓組織已存在缺血缺氧改變，隨著機械壓迫解除，不可避免地出現(xiàn)脊髓原缺血局部組織血供驟然增加，即脊髓由缺血狀態(tài)轉變?yōu)樵俟嘧顟B(tài)[6]。

本研究結果顯示，復方丹參注射液對脊髓損傷具有治療作用，且與減壓術有協(xié)同作用。既往采用復方丹參注射液治療大鼠脊髓損傷動物模型的研究亦表明復方丹參治療能夠顯著改善動物模型的后肢運動功能評分[7-8]。

對各組動物模型頸髓的組織學檢查顯示，復方丹參+減壓組第1天頸髓神經元水腫及神經膠質細胞增生較減壓組輕，無膠質細胞的浸潤，28天時頸髓組織未見明顯病變，神經元形態(tài)正常。提示復方丹參注射液對損傷頸髓內神經元具有保護作用。劉世清等[9]研究顯示復方丹參治療后動物脊髓組織出血壞死范圍較局限，組織水腫較輕，神經細胞腫脹較輕，與本研究結果一致。

丹參主要通過增加毛細血管開放，擴張微動脈，增加微循環(huán)的血流量，降低微循環(huán)阻力，從而增加微循環(huán)血液灌流[10]。范里等[11]觀察了骨骼肌缺血再灌注前后微循環(huán)變化，發(fā)現(xiàn)靜注丹參可顯著改善微循環(huán)，減輕骨骼肌損傷。本研究結果顯示，在第28天時，復方丹參+減壓組的血管數(shù)顯著多于壓迫組，且多于減壓組，提示復方丹參注射液可改善微循環(huán)，增強減壓術的效果。

頸髓組織的TUNEL檢測結果提示，復方丹參注射液在減壓術后可減輕缺血再灌注損傷導致的神經元受損，減少脊髓細胞凋亡。采用復方丹參注射液治療大鼠脊髓損傷動物模型的研究表明，復方丹參治療能顯著抑制損傷脊髓內的細胞凋亡[8-9]，與本研究結果一致。研究發(fā)現(xiàn)，局部缺血和再灌注損傷在神經變性的過程中也起了非常重要的作用[4]。在脊髓繼發(fā)性損傷中，神經細胞與神經膠質細胞均發(fā)生了凋亡與壞死。復方丹參注射液能對抗脊髓損傷后神經細胞凋亡，并能顯著抑制誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的過量表達，從而實現(xiàn)對脊髓損傷的保護作用[9]。對大鼠脊髓損傷后脊髓細胞進行流式細胞儀的檢測，發(fā)現(xiàn)應用復方丹參注射液后脊髓細胞發(fā)生凋亡的數(shù)目顯著性減少，因此認為其可能通過抑制脊髓細胞凋亡這一途徑，減輕或逆轉繼發(fā)損傷的病理過程，而發(fā)揮對脊髓損傷的治療作用[7]。

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（收稿：2016-02-20 修回：2016-05-05）

Adjuvant Therapeutic Effect of Compound Radix Salviae Miltiorrhizae on Decompression of Compressive Cervical Spinal Cord Injury in Rabbits

BIAN Zhenyu,WANG Lei,LI Maoqiang,WANG Xuepeng,ZHU Liu-long. Department of Orthopaedics,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the protective effect of compound radix salviae miltiorrhizae injection on ischemic reperfusion injury after decompression of compressive spinal cord injury.MethodsTwenty-four male New Zealand Rabbits were randomly divided into model group,compound radix salviae miltiorrhizae injection+decompression group（combined treatment group）,decompression alone group,and healthy group,with 6 rabbits in each group.Compressive cervical spinal cord injury model was set up in all groups except for healthy group.Combined treatment group was treated with compound radix salviae miltiorrhizae injection of 2 g/（kg·d）before and after decompression,model group and decompression alone group were treated with the equivalent volume of saline,and healthy group received no intervention procedure.Tarlov scores,cell apoptosis,histological and immunohistochemical features of cervical spinal cords after treatment were compared among groups.ResultsTarlov scores of combined treatment group on day 1 and day 28 after decompression were 5.33±0.58 and 6.00±0.00,which were significantly higher than those of decompression group（3.67±0.58 and 5.00±0.00）,with P＜0.05.Histological examination demonstrated that neuron swelling and neuroglia proliferation of cervical spinal cord in combined treatment group were less severe compared with those of decompression group.Immunohistochemical assay of cervical spinal cord using CD31 indicated that the number of blood vessels in combined treatment group were 12.33±2.12,which were significantly more than that of compression group（5.67±2.50）and decompression group（9.78±2.17）on day 28 afterdecompression,with all P＜0.05.Tunnel assay showed that apoptosis index of cervical spinal cord in combined treatment group were 0.89±0.33 and 0.56±0.53,which were significantly lower than those of compression group （2.22±1.56 and 4.00±2.12,P＜0.05）and decompression group（1.78±0.67 and 1.67±0.50,P＜0.05）on day 1 and 28 after decompression,but did not differ from those of healthy group（0.78±0.44 and 0.56±0.53,P＞0.05）.Conclusion Compound radix salviae miltiorrhizae can improve microcirculation of spinal cord after decompression of compressive spinal cord injury,decrease ischemic reperfusion injury after decompression,enhance therapeutic effects of decompression,and promote motor function recovery after operation.

rabbits;compressive cervical spinal cord injury;decompression;ischemic reperfusion injury;compound radix salviae miltiorrhizae

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2011ZA078）

杭州市第一人民醫(yī)院骨科（杭州 310006）

朱六龍，Tel：13486100812；E-mail：zhuliulong@sina.com