HPLC與UV-VIS法測定骨修復(fù)材料復(fù)合納米微球中左氧氟沙星的比較*

王琦 陳誠 何小強 黃偉

HPLC與UV-VIS法測定骨修復(fù)材料復(fù)合納米微球中左氧氟沙星的比較*

王琦 陳誠 何小強 黃偉*

目的 比較高效液相色譜法（High performance liquid chromatography,HPLC）與紫外-可見分光光度計法（Ultraviolet-visible spectroscopy,UV-VIS）檢測納米微球中的左氧氟沙星，為評價可控降解骨修復(fù)材料中的藥物緩釋提供方法學(xué)。方法 直接測定標(biāo)準(zhǔn)品左氧氟沙星，繪制兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍內(nèi)選低、中、高3個濃度，計算回收率。將10個載藥骨修復(fù)材料（10mm×6mm×6mm）分別浸泡于3 mL模擬體液中，1天后取樣，經(jīng)兩種方法檢測，配對t檢驗，比較兩種方法測得的結(jié)果有無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果 HPLC法的線性回歸方程：Y=0.0334X-0.01（r=0.9996），線性范圍：（0.5～250） g/mL。UV-VIS法的線性回歸方程為：Y=0.06588X+0.01669（r=0.9999），線性范圍：（0.5～50） g/mL。HPLC 法在低、中、高濃度的回收率分別為：（96.33±0.58）%、（111.00±0.00）%、（105.00±0.00）%，RSD分別為0.37%、0.17%、0.06%；UV-VIS法的回收率分別為：（96.00±2.00）%、（99.00±0.00）%、（98.66±0.00）%，RSD分別為 1.34%、0.00%、0.03%。HPLC法測得的平均濃度為：（30.43±10.27） g/mL；UV-VIS法測得的平均濃度為：（187.93±33.52） g/mL。兩種方法測得的結(jié)果有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（t=20.169，=0.000）。結(jié)論HPLC法專屬性強、回收率高、精確度高，是評價納米微球載左氧氟沙星可控降解骨修復(fù)材料中藥物緩釋的理想方法。

左氧氟沙星；骨修復(fù)材料；納米微球；高效液相色譜法；紫外可見分光光度計法

左氧氟沙星為第3代喹諾酮類藥物[1]，其作用機制為抑制細菌的Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶，干擾 DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程[2]，其有廣譜抗菌作用[3]，因而廣泛應(yīng)用于敏感菌引起的各個系統(tǒng)感染[4-7]。本文將磁性介孔硅納米顆粒與左氧氟沙星結(jié)合，再與羥基磷灰石、殼聚糖復(fù)合，得到一種具有藥物緩釋性能的高分子骨修復(fù)復(fù)合材料。

目前，檢測左氧氟沙星常用的方法為高效液相色譜法（High performance liquid chromatography,HPLC）[8]、紫外-可見分光光度計法（Uv-visible spectrophotometer,UV-VIS）[9]和微生物法[10]，許多研究者應(yīng)用這些方法檢測了血漿、片劑、注射液中的左氧氟沙星。本文采用HPLC和UV-VIS兩種方法對所制備復(fù)合材料中左氧氟沙星進行了檢測，并對兩種方法的可靠性進行了比較。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（LC-2010AHT，日本島津公司）；高速離心機（SigmaD-37520，美國）；超聲波清洗器（KQ2200B，昆山市超聲儀器有限公司）；Elix10超純水凈化系統(tǒng)（Milli-QGradientA10，美國）；紫外可見分光光度計（UV-2600，日本島津公司）；XS-10510-6電子天平（METTLERTOLEDO，瑞士）；氮氣干燥儀（River Road West Berlin MA 01301，美國）；改良型SBF模擬體液（赫特生物技術(shù)有限公司）。四丁基溴化銨（分析純，批號：20141103；國藥集團生產(chǎn)）；環(huán)丙沙星對照品（含量≥98%，批號：17850-5G-F,Sigma-Aldrich，美國）；左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥98%，中國食品藥品檢定研究院，批號：130455-201106）；雙蒸水；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 HPLC法色譜條件

色譜柱為Sepax BR-C18（250mm×4.6mm 5 m），流動相為0.01mol/L磷酸二氫鉀-甲醇-0.5 mol/L四丁基溴化銨（75∶25∶4），流速1.0 ml/min，柱溫40℃，紫外檢測波長290 nm。進樣量10 L。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

稱15.00mg左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，于模擬體液中溶解，轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中定量（3mg/mL），倍比稀釋，分13個濃度 梯 度：300、200、100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05 g/mL。取環(huán)丙沙星25.04mg稱定，置于25 mL的容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，稀釋成濃度為500.8 g/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2.3 UV-UIS法波長選擇

按1.2.2的方法配制標(biāo)準(zhǔn)品，選高、中、低等多個不同的濃度，儀器調(diào)零后，將標(biāo)準(zhǔn)品左氧氟沙星經(jīng)儀器在200～400nm處掃描，確定最大吸收波長。

1.2.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

建立HPLC法標(biāo)準(zhǔn)曲線：取100 L空白模擬體液，分別將13個不同濃度梯度的10 L標(biāo)準(zhǔn)工作液加入，同時加入10 L內(nèi)標(biāo)環(huán)丙沙星，渦旋混勻5分鐘，加入800 L二氯甲烷，渦旋5分鐘，8000 rpm/min離心5分鐘。取上清液750 L，50°C水浴下氮氣吹干，加入100 L流動相溶解，超聲、渦旋、12000rpm/min離心10分鐘，取上清液10 L進樣分析。每個濃度分析3次。以左氧氟沙星與內(nèi)標(biāo)環(huán)丙沙星峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，左氧氟沙星的濃度（X）為橫坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法（W=1/C2）進行回歸計算。

建立UV-VIS法標(biāo)準(zhǔn)曲線：取3mL空白模擬體液直接掃描并將儀器調(diào)零。將不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品掃描，以吸光度值為縱坐標(biāo)，左氧氟沙星濃度為橫坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法（W=1/C2）進行回歸計算。

1.2.5 回收率實驗

分別制備左氧氟沙星濃度為5、25、50 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品各3份，作為質(zhì)控樣品，HPLC法按“1.2.4”項下方法處理、檢測。UV-VIS法按1.2.4項下方法處理，實測濃度與理論濃度的比值為方法回收率。

1.2.6 真實樣品測定

HPLC法樣品處理：取10個經(jīng)-鈷60輻射滅菌的新型納米微球載左氧氟沙星可控降解骨修復(fù)材料（大?。?0 mm×6mm×6mm），分別浸泡于裝有3 mL改良型模擬體液的EP管中，于37°C恒溫箱浸泡24小時，隨后將材料取出，樣品置于-20°C冰箱保存，備測。其余步驟同1.2.4項，每個濃度分析3次。UV-VIS法樣品處理：將同一批次的10個樣品，用模擬體液稀釋100倍后，取3 mL裝入石英比色皿，在特定波長掃描，記錄吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得藥物濃度。

1.3 統(tǒng)計方法

使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩種方法測定結(jié)果比較采用配對檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）=標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）/計算結(jié)果的算術(shù)平均值（X）×100%。

2 結(jié)果

2.1 HPLC法色譜條件

左氧氟沙星和內(nèi)標(biāo)環(huán)丙沙星的保留時間分別為4.84分鐘和6.74分鐘，其余雜質(zhì)對樣品的測定無干擾，兩者峰形良好，分離完全。樣品色譜圖（圖1a、b）。

圖1 HPLC法與UV-VIS法的各組色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 UV-VIS法波長選擇

將模擬體液作為空白對照組與加入標(biāo)準(zhǔn)品左氧氟沙星的樣品作為實驗組進行掃描，可以發(fā)現(xiàn)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品左氧氟沙星在288.4 nm處有最大吸收波長，故選288.4 nm作為UV-VIS法檢測樣品的波長（圖2 a）。（彩圖見插頁）

圖2 不同濃度左氧氟沙星的圖譜

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

HPLC法的回歸方程：Y=-0.01+0.0334X（r=0.9996），線性范圍：（0.5～250） g/mL。UV-VIS法的回歸方程為：Y=0.06588X+0.01669（r=0.9999），線性范圍：（0.5～50） g/ mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖（圖1c、f）。

2.4 回收率實驗

HPLC法測定低、中、高（5、25、50 g/mL）3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,其回收率分別為（96.33±0.58）%、（111±0.00）%、（105±0.00）%，RSD分別為0.37%、0.17%、0.06%。UV-VIS法測定低、中、高（5、25、50 g/mL）3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,其回收率分別為（96.00±2.00）%、（99.00±0.00）%、（98.66±0.00）%，RSD分別為1.34%、0.00%、0.03%。達到了藥典規(guī)定的回收率范圍：80%～120%。

2.5 真實樣品測定

UV-VIS法測得的10個樣品均值為（187.93±33.52） g/ mL，HPLC法測得的10個樣品均值為（30.43±10.27）g/mL。兩組結(jié)果進行配對t檢驗，兩種方法測得的結(jié)果有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（t=20.169，=0.000）。以UV-VIS測得的結(jié)果為Y，以HPLC測得的結(jié)果為X進行相關(guān)性分析，其線性方程為Y=2.94X+98.57，相關(guān)系數(shù)r=0.899（=0.000）（圖3）。

圖3 兩組結(jié)果進行相關(guān)性分析

3 討論

慢性骨髓炎是骨與骨髓的慢性感染[11]，發(fā)病率逐漸增高[12]，臨床上治療非常棘手。左氧氟沙星具有廣譜抗菌且分子量較小[13]，可將其裝載于磁性介孔硅納米微球，合成一種新型載藥可控降解骨修復(fù)材料，用于治療慢性骨髓炎。為了客觀評價納米微球載藥可控降解骨修復(fù)材料中藥物在體內(nèi)外的緩釋特點，建立正確的方法是必要的。目前檢測左氧氟沙星常用的方法為：HPLC法[8,13]、UV-VIS法[9]、微生物法[10]。

HPLC法的流動相開始為0.01mol/L磷酸二氫鉀-甲醇溶液，左氧氟沙星出峰處有拖尾現(xiàn)象，加入四丁基溴化銨[14,15]離子對試劑后，拖尾消失。最終將流動相確定為：0.01mol/ L磷酸二氫鉀-甲醇-0.5mol/L四丁基溴化銨。環(huán)丙沙星化學(xué)性質(zhì)與左氧氟沙星類似，故將其作為內(nèi)標(biāo)[16]。兩者極易溶解于有機溶劑中，因此選二氯甲烷作為萃取劑，為了保證充分萃取樣品中的藥物，樣品與萃取劑的比例為1:8[17]。HPLC法的回收率在96%～105%之間，達到了《中華人民共和國藥典》規(guī)定的波動范圍：80%～120%[18]。

當(dāng)測定無雜質(zhì)干擾的標(biāo)準(zhǔn)品時，兩種方法均有較高的回收率且達到了藥典規(guī)定的要求，但UV-VIS法測定真實樣品時的圖譜較標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)生明顯改變，考慮有雜質(zhì)干擾左氧氟沙星的吸光度，雜質(zhì)會干擾 UV-VIS測定的準(zhǔn)確性。UV-VIS法的線性范圍較HPLC窄，回收率在96%～98%之間，分析原因為 UV-VIS工作原理為朗伯比爾定律[19,20]，吸光度值（A）與其透射比的倒數(shù)（1/T）成對數(shù)函數(shù)關(guān)系，所以吸光度值與濃度只在較小的范圍內(nèi)成線性關(guān)系。

同一批樣品經(jīng)UV-VIS法檢測的濃度明顯高于HPLC法，兩組結(jié)果呈現(xiàn)正相關(guān)線性關(guān)系。UV-VIS法操作簡單，成本較低，但無法排除雜質(zhì)的干擾，線性范圍較窄。由于不同材料載藥量的差異，藥物緩釋量有較大差異，會超出UV-VIS法的線性范圍，最終導(dǎo)致UV-VIS法無法測出藥物濃度。左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品是在288.4nm波長處出峰，將真實樣品直接通過UV-VIS測定，由于雜質(zhì)干擾、藥物濃度過高等因素，超過UV-VIS法的可響應(yīng)的吸光度值，左氧氟沙星不能測出（圖2 b，紅色線條）。將真實樣品稀釋一定倍數(shù)之后檢測，雖然吸光度值在線性范圍內(nèi)，但考慮有雜質(zhì)使得吸光度值增加，從而使UV-VIS測定的結(jié)果偏高。因此，UV-VIS法不能達到測定的要求。HPLC法可以將樣品中各種雜質(zhì)在色譜柱中進行分離，排除了雜質(zhì)對左氧氟沙星的干擾，專屬性強，精度高、回收率高。綜上所述，HPLC法是評價納米微球載左氧氟沙星可控降解骨修復(fù)材料藥物緩釋的理想方法。

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Comparison of bone repair materials composite nanospheres levofloxacin by HPLC with UV-VIS method

Wang Qi,Chen Cheng,He Xiaoqiang,et al.
Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing,400016,China

Objective Comparison of highperformanceliquidchromatography(HPLC)withUV-visiblespectrophotometer (UV-VIS)detect levofloxacin in nanoparticles.To establish a methodology for the evaluation of drug release from the bone repair material.Methods We use different concentrations of standard levofloxacin to establish a standard curve. Choose low,medium,high concentrations within the linear range,then calculate the recovery rate.A total of 10 drugloadedbone repairmaterial(10mm×6mm×6mm)were immersedin3mL SBFIndividually.All thematerialswere carried out for testing.The paired t-test was used to see if there are significant differences between the two results.Results The linear equations by HPLC method was:Y=0.0334X-0.01(r=0.9996),The calibrationcurve showed linearity over a concentrationrange from0.5to250 g/3mL;The linear equationsbyUV-VIS method was:Y=0.06588X+0.01669(r=0.9999), The calibration curve showed linearity over a concentration range from 0.5 to 50 g/3mL.Three different concentrations of sample recoveries by HPLC were(96.33±0.58)%,(111.00±0.00)%,(105.00±0.00)%，relative standard deviation were 0.37%,0.17%,0.06%;Three different concentrations of sample recoveries by UV-VIS were(96.00±2.00)%, (99.00±0.00)%,(98.66±0.00)%,relative standard deviation were 1.34%,0.00%,0.03%.The average concentration of HPLC method was(30.43±10.27) g/mL;The average concentration of UV-VIS method was(187.93±33.52) g/ mL.There was significant statistical difference between the results obtained by the two methods(=20.169,=0.000). Conclusion HPLC method was found to be specific,high recovery rate,high accuracy,HPLC method was an ideal method for the evaluation of drug release from the bone repair material.

Levofloxacin;Bone repair material;Nanoparticles;HPLC;UV-VIS

R681.21；R917.1

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.06.08

swgk2015-12-00259

王琦（1989-）男，碩士，醫(yī)師。研究方向：人工骨修復(fù)材料，骨關(guān)節(jié)外科。

2015-12-22）

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）資助項目（編號：2013AA032203）；重慶市研究生科研創(chuàng)新基金資助項目（編號：CYS14121）

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，重慶400016