液態(tài)羥基磷灰石膠原海藻酸鈉（Alg/nHAC）人工骨促進(jìn)Ilizarov骨延長(zhǎng)骨愈合的實(shí)驗(yàn)研究*

朱超王華劉偉王邵清王斌馮慶玲劉新暉*

液態(tài)羥基磷灰石膠原海藻酸鈉（Alg/nHAC）人工骨促進(jìn)Ilizarov骨延長(zhǎng)骨愈合的實(shí)驗(yàn)研究*

朱超1王華1劉偉1王邵清1王斌1馮慶玲2劉新暉1*

目的探討應(yīng)用液態(tài)海藻酸鈉/納米羥基磷灰石/膠原（Alg/nHAC）促進(jìn)肢體延長(zhǎng)過(guò)程中骨愈合的作用。方法制備液態(tài)可注射Alg/nHAC人工骨，建立兔脛骨骨延長(zhǎng)動(dòng)物模型，隨機(jī)分兩組，A組，骨延長(zhǎng)區(qū)給予微創(chuàng)注射Alg/nHAC人工骨，B組作為空白對(duì)照，分別在延長(zhǎng)后2、4、8周進(jìn)行組織學(xué)，X線檢查、新生骨小梁百分比、骨密度以及生物力學(xué)的檢測(cè)觀察延長(zhǎng)區(qū)骨愈合情況。結(jié)果延長(zhǎng)后2、4、8周，A組在組織學(xué)、新生骨小梁百分比、骨密度以及生物力學(xué)的檢測(cè)均明顯優(yōu)于B組，A組8周時(shí)間骨延長(zhǎng)區(qū)已經(jīng)愈合。結(jié)論液態(tài)羥基磷灰石膠原海藻酸鈉（Alg/nHAC）人工骨可以通過(guò)微創(chuàng)注射的方式促進(jìn)延長(zhǎng)區(qū)骨愈合，為臨床促進(jìn)骨愈合提供了新的方法。

海藻酸鈣/納米羥基磷灰石/膠原；伊力扎洛夫；骨愈合

隨著Ilizarov牽拉骨再生的生物學(xué)原理的創(chuàng)立及其在臨床中的應(yīng)用，給肢體延長(zhǎng)技術(shù)帶來(lái)了革命性的變化。但是臨床中發(fā)現(xiàn)，隨著延長(zhǎng)幅度的加大，延長(zhǎng)后的并發(fā)癥逐漸增加，其中骨愈合較緩慢是其中重要的并發(fā)癥之一[1]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立兔脛骨肢體延長(zhǎng)的動(dòng)物模型觀察了和探討了應(yīng)用液態(tài)海藻酸鈉/納米羥基磷灰石/膠原（Alg/nHAC）微創(chuàng)法促進(jìn)肢體延長(zhǎng)過(guò)程中骨愈合的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

健康新西蘭大耳白兔60只，南京醫(yī)科大學(xué)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（2～2.5kg），海藻酸鈉/納米羥基磷灰石/膠原（Alg/nHAC），12mm克氏針，飛利浦500mAX線機(jī)拍片，IPP（Image-ProPlusIPP）Mediaplayer，DEXAUNIT-2000雙能 X線骨密度儀器，USS生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)，自動(dòng)脫水機(jī)TP102，切片機(jī)2125，自動(dòng)石蠟包埋機(jī) TKY-BM，烤片機(jī)HI1220，推片機(jī)HI1210，雙目照相奧林巴斯顯微鏡CX31，圖像分析系統(tǒng)。

1.2 兔脛骨肢體延長(zhǎng)動(dòng)物模型的制備[2]

新西蘭大耳白兔（2～2.5kg），術(shù)前禁食，備左后肢皮膚，1%戊巴比妥鈉靜脈麻醉（3mg/kg）。麻醉成功后，兔仰臥于兔臺(tái)，消毒鋪單。先用電鉆在脛骨結(jié)節(jié)上方約1.0cm處交叉鉆入2枚1.2mm克氏針，安裝預(yù)先裝配好的外固定架的一個(gè)環(huán)，并將克氏針固定在鋼環(huán)上，遠(yuǎn)端也交叉鉆入2枚1.0mm克氏針，與近端克氏針相對(duì)應(yīng)，同樣用螺栓將針固定在鋼環(huán)上。調(diào)整外固定架，使外固定架牢固，平行。在無(wú)菌條件下于上、下2組鋼針之間取脛骨前外側(cè)縱行切口，深達(dá)骨膜，并于骨膜下剝離，顯露脛骨上段，小心撬斷腓骨下端，并用線鋸于脛骨結(jié)節(jié)下完全截?cái)嗝劰?，調(diào)整外固定架，使骨折兩端靠攏并保持解剖對(duì)位，擰緊所有的螺帽。沖洗傷口，縫合骨膜后關(guān)閉切口（圖1，圖2）。（彩圖見(jiàn)插頁(yè)）術(shù)后應(yīng)用青霉素40萬(wàn)U肌肉注射5天，同時(shí)在刀口及針道處安爾碘濕敷，預(yù)防感染。術(shù)后第5天開(kāi)始延長(zhǎng)，延長(zhǎng)速度為1mm/d，分2次完成，共20天，延長(zhǎng)20mm。延長(zhǎng)完成后固定9周。按相同條件常規(guī)飼養(yǎng)，任兔在籠中自由活動(dòng)。定期處死動(dòng)物，取標(biāo)本。

圖1 橫行截骨后

圖2 兔脛骨肢體延長(zhǎng)動(dòng)物型制備術(shù)后

1.3 海藻酸鈉/納米羥基磷灰石/膠原（Alg/nHAC）的制備[3]

1.4 動(dòng)物分組

取60只新西蘭大耳白兔，（2～2.5kg），隨機(jī)分成A、B兩組，每組30只。待延長(zhǎng)結(jié)束后，A組延長(zhǎng)區(qū)注射液態(tài)Alg/ nHAC，B組未給與任何處置作為對(duì)照。A、B兩組在相同條件下進(jìn)行造模及飼養(yǎng)，任兔在籠中自由活動(dòng)。定期處死動(dòng)物，取標(biāo)本。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大體觀察

觀察術(shù)后傷口愈合情況，針道是否感染及日?；顒?dòng)情況，延長(zhǎng)區(qū)大體標(biāo)本成骨情況。

1.5.2 組織學(xué)觀察

分別在骨延長(zhǎng)中期及結(jié)束后、延長(zhǎng)結(jié)束后第2、4、8周處死動(dòng)物取材，標(biāo)本用10%甲醛固定，已骨化的標(biāo)本脫鈣2周，石蠟包埋切片，HE染色，封片后光鏡下觀察。

1.5.3 X線觀察

術(shù)后、骨延長(zhǎng)結(jié)束后及延長(zhǎng)結(jié)束后第2、4、8周，飛利浦500mAX線機(jī)拍片，曝光條件為：50KV，4ms。觀察延長(zhǎng)部位的成骨及骨痂形成情況。

1.5.4 骨小梁百分比面積測(cè)定

鏡下觀察組織切片，采集圖像，應(yīng)用 IPP（Image-Pro PlusIPP）Mediaplayer形態(tài)計(jì)量軟件測(cè)定骨小梁百分比面積測(cè)定

1.5.5 骨密度測(cè)定

于延長(zhǎng)結(jié)束后8周，每組各處死5只兔子取材，在DEXAUNIT-2000雙能X線骨密度儀器測(cè)定骨密度。

1.5.6 生物力學(xué)測(cè)定

分別與 2、4、8周兔脛骨延長(zhǎng)區(qū)進(jìn)行三點(diǎn)彎實(shí)驗(yàn)。A組、B組每個(gè)時(shí)間段各5個(gè)標(biāo)本，并取對(duì)側(cè)正常脛骨5個(gè)標(biāo)本設(shè)為C組做對(duì)照。標(biāo)本中點(diǎn)為支點(diǎn)，兩端固定，以30mm為跨距，以0.5mm/min的恒定速度均勻緩慢加載至其斷裂，取均值對(duì)比各組最大應(yīng)力值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。＜0.05或0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

術(shù)后兔子飲食、活動(dòng)正常，患肢輕度腫脹，1～2周后消腫，切口均正常愈合。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有2只兔子因腹瀉死亡，2只兔子于克氏針固定處骨折，上述動(dòng)物排除實(shí)驗(yàn)，剩余兔子均生存到實(shí)驗(yàn)所需的各時(shí)間段。外固定架固定可靠，未對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生不良影響。

2.1 大體觀察

骨延長(zhǎng)結(jié)束后取標(biāo)本10個(gè)，見(jiàn)延長(zhǎng)區(qū)為致密纖維結(jié)締組織，質(zhì)柔韌，未見(jiàn)骨化。延長(zhǎng)結(jié)束后第2周，共處死10只兔子取標(biāo)本，每組5個(gè)。A組延長(zhǎng)區(qū)大部分骨化，手術(shù)刀片切割骨痂較困難；B組延長(zhǎng)區(qū)少部分骨化，仍存在大部分纖維結(jié)締組織。延長(zhǎng)結(jié)束后第4周，共處死10只兔子取標(biāo)本，每組5個(gè)。A組延長(zhǎng)區(qū)已完全骨化，但強(qiáng)度但強(qiáng)度較健側(cè)弱，可輕易用手折斷；B組延長(zhǎng)區(qū)基本已骨化，骨痂強(qiáng)度不大，可用手術(shù)刀片切割。延長(zhǎng)結(jié)束后第8周，共處死10只兔子取標(biāo)本，每組5個(gè)。A、B組延長(zhǎng)區(qū)全部骨化，A組外觀已與正常骨相類似，用手難于折斷；B組可輕易用手折斷。手術(shù)側(cè)脛骨與健側(cè)脛骨比較，延長(zhǎng)了2cm。

2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

延長(zhǎng)中期及結(jié)束后：共處死10只兔子取標(biāo)本，中期5個(gè)，延長(zhǎng)結(jié)束后5個(gè)。延長(zhǎng)區(qū)為致密纖維結(jié)締組織充填，未觀察到骨組織。延長(zhǎng)結(jié)束后第2周：共處死10只兔子取標(biāo)本，每組5個(gè)。A組植入的材料被纖維性結(jié)締組織分割。纖維性結(jié)締組及血管長(zhǎng)入植入材料的內(nèi)部，在大部分材料中間能看到纖維性骨痂為主的類骨質(zhì)形成，而被分割材料的周邊出現(xiàn)少量的骨性骨痂；B組以纖維結(jié)締組織為主，有少量的類骨質(zhì)形成。延長(zhǎng)結(jié)束后第4周：共處死10只兔子取標(biāo)本，每組5個(gè)。A組：可見(jiàn)大部分成熟骨，骨陷窩及其內(nèi)骨細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，植入的材料明顯減少；B組出現(xiàn)大量類骨質(zhì)出現(xiàn)，形成編織骨，骨小梁漸成熟，部分成骨細(xì)胞逐漸成熟變?yōu)楣羌?xì)胞，骨小梁較2周時(shí)增多，仍以幼稚骨小梁為主。延長(zhǎng)結(jié)束后第8周，共處死10只兔子取標(biāo)本，每組5個(gè)。A組：注入的材料基本消失，大量的成熟骨性骨痂形成（圖3）（彩圖見(jiàn)插頁(yè)）；B組以大量纖維行骨痂和骨性骨痂為主，有少量的成熟骨陷窩及骨細(xì)胞出現(xiàn)（圖4）（彩圖見(jiàn)插頁(yè)）。

圖3 延長(zhǎng)結(jié)束后第8周A組：注入的材料基本消失，只有在中心存在有極少量的材料，大量的成熟骨性骨痂形成（HE×100）

圖4 延長(zhǎng)結(jié)束后第8周B組以大量纖維行骨痂和少量的骨性骨痂為主，有成熟骨陷窩及骨細(xì)胞出現(xiàn)（HE×100）

2.3 X線檢查

術(shù)后即刻拍片示脛骨截骨完全，腓骨亦斷開(kāi)，截骨處對(duì)位、對(duì)線佳；延長(zhǎng)后10天拍片示截骨部位已牽開(kāi)，對(duì)位對(duì)線良好；延長(zhǎng)結(jié)束后即刻拍片，牽開(kāi)約2cm，對(duì)位對(duì)線良好，延長(zhǎng)區(qū)低密度顯影，未見(jiàn)鈣化（圖5）。A組注射液態(tài)Alg/nHAC也為低密度顯影（圖6）。延長(zhǎng)結(jié)束后第2周：A組大量的高密度影形成并充填于延長(zhǎng)區(qū)；B組僅見(jiàn)少量高密度顯影，即僅有少量的新生骨形成，延長(zhǎng)區(qū)大部分為低密度顯影。延長(zhǎng)結(jié)束后第4周：A組延長(zhǎng)區(qū)高密度較2周明顯增高增多；B組骨痂量較2周時(shí)增多，但比A組少。延長(zhǎng)結(jié)束后第8周：A組影像表現(xiàn)已接近正常骨，髓腔貫通，延長(zhǎng)區(qū)皮質(zhì)骨與上下鄰近部位正常骨密度相似（圖7）；B組延長(zhǎng)區(qū)全部骨化，但骨密度較低，骨量不多（圖8）。

圖5 延長(zhǎng)結(jié)束后即刻拍片牽開(kāi)約2cm，對(duì)位對(duì)線良好，延長(zhǎng)區(qū)低密度顯影，未見(jiàn)鈣化

圖6 A組注射液態(tài)NHAC/Alg也為低密度顯影

圖7 延長(zhǎng)結(jié)束后第8周A組影像表現(xiàn)已接近正常骨，髓腔貫通，延長(zhǎng)區(qū)皮質(zhì)骨與上下鄰近部位正常骨密度相似

圖8 延長(zhǎng)結(jié)束后第8周B組延長(zhǎng)區(qū)全部骨化，但骨密度較低，骨量不多

2.4 骨小梁百分比面積測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)共獲取30個(gè)標(biāo)本，其中2周時(shí)：10個(gè)標(biāo)本（A組5個(gè)，B組5個(gè)）；4周時(shí)：10個(gè)標(biāo)本（A組5個(gè)，B組5個(gè)）；8周時(shí)：10個(gè)標(biāo)本（A組5個(gè)，B組5個(gè)）。測(cè)定結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示A、B兩組分別在2、4、8周有顯著性差異，＜0.01；A組的骨小梁百分比面積明顯高于B組，見(jiàn)表1。

表1 兩組動(dòng)物在不同時(shí)間段骨小梁百分比面積比較（±s）

表1 兩組動(dòng)物在不同時(shí)間段骨小梁百分比面積比較（±s）

組別 2周 4周 8周A組B組值7.1 9.60值11.2±2.01 32.42±2.88 51.49±9.28 4.51±1.83 18.68±3.77 33.11±4.11 10.9＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.5 骨密度測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)8周時(shí)共獲取10個(gè)標(biāo)本：（A組5個(gè)，B組5個(gè)）。以對(duì)側(cè)正常脛骨（取10個(gè)標(biāo)本）作為C組測(cè)量正常值。

A 組 BMD 為（0.1240±0.0069）、B 組 BMD 為（0.0873±0.0042）、C組BMD為（0.1771±0.0078）。A組在8周時(shí)BMD高于B組。兩組之間有顯著性差異（＜0.01）。A組在8周時(shí)恢復(fù)到正常值的70.29%，B組恢復(fù)到正常值的49.29%，兩組之間有顯著性差異（＜0.01）。

2.6 生物力學(xué)測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)8周時(shí)共獲取10個(gè)標(biāo)本：（A組5個(gè)，B組5個(gè)），并取5個(gè)對(duì)側(cè)正常脛骨（取10個(gè)標(biāo)本）作為 C組測(cè)量正常值。

A組的最大折彎應(yīng)力為（273.524±50.680）N（圖9）、B組最大折彎應(yīng)力為（132.471±37.010）N（圖10）、C組的最大折彎應(yīng)力為（396.570±45.121）N（圖11）。A組在8周時(shí)最大折彎應(yīng)力高于B組。兩組之間有顯著性差異（＜0.01）。A組在8周時(shí)恢復(fù)到正常值的68.94%，B組恢復(fù)到正常值的33.33%，兩組之間有顯著性差異（＜0.01）。（圖9-圖11彩圖見(jiàn)插頁(yè)）

圖9 A組最大折彎應(yīng)力

圖10 B組最大折彎應(yīng)力

圖11 C組最大折彎應(yīng)力

3 討論

本世紀(jì)50年代末60年代初，Ilizarov提出了牽張應(yīng)力效應(yīng)、環(huán)型外固定器與臨床應(yīng)用技術(shù)，使骨骼延長(zhǎng)術(shù)得以廣泛的應(yīng)用，被譽(yù)為矯形外科的第4個(gè)里程碑[4]。雖然Ilizarov肢體延長(zhǎng)術(shù)被稱為是骨科治療學(xué)上的一次革命，但由于其骨愈合較緩慢，并有較多的并發(fā)癥。由于每天僅僅能以1.0mm左右的速度牽拉，加上延長(zhǎng)區(qū)骨愈合時(shí)間，每延長(zhǎng)1.0mm約需一兩個(gè)月的時(shí)間，如延長(zhǎng)5.0mm約需半年左右的時(shí)間[5]。因此，許多學(xué)者在促進(jìn)骨愈合的機(jī)制和方法上進(jìn)行了探索。Kassis[6]在延長(zhǎng)結(jié)束后立即對(duì)延長(zhǎng)區(qū)施加軸向微動(dòng)刺激，觀察到軸向微動(dòng)刺激能增加骨痂體積、骨痂礦物質(zhì)含量及密度，有利于骨愈合；Kitoh[7]應(yīng)用自體骨髓干細(xì)胞植入延長(zhǎng)區(qū)觀察到明顯的促進(jìn)了骨愈合。徐鵬[8]等通過(guò)延長(zhǎng)區(qū)注射rhBMP2觀察到可明顯促進(jìn)延長(zhǎng)區(qū)的骨修復(fù)。

上述方法雖有一定效果，作者對(duì)結(jié)果未能十分滿意。既往的研究證實(shí)納米羥基磷灰石有促進(jìn)骨化和再生的能力[9]，而膠原是一種天然高分子材料，具有優(yōu)異的生物相容性和生物活性[10]。本試驗(yàn)應(yīng)用制備的液態(tài)Alg/nHAC，通過(guò)微創(chuàng)的方法將Alg/nHAC注射到兔子脛骨延長(zhǎng)的動(dòng)物模型延長(zhǎng)區(qū)，分別從大體角度和組織學(xué)角度都觀察到Alg/nHAC組新生成的骨痂明顯多于對(duì)照組，從X線也見(jiàn)到Alg/nHAC組在不同時(shí)間段的延長(zhǎng)區(qū)新形成的高密度均優(yōu)于對(duì)照組。通過(guò)測(cè)定骨密度和生物力學(xué)檢測(cè)也證實(shí)治療組骨修復(fù)程度和強(qiáng)度均高于對(duì)照組，所以證實(shí)Alg/nHAC是有效的、理想的一種促進(jìn)牽拉成骨愈合的新型材料。且Alg/nHAC可制備成液態(tài)通過(guò)注射微創(chuàng)的方法應(yīng)用，具備創(chuàng)傷小恢復(fù)快的特點(diǎn)。Alg/nHAC促進(jìn)牽拉成骨主要有以下兩方面原因。一方面，納米羥基磷灰石的微結(jié)構(gòu)可以增加植入物的表面面積。這種結(jié)結(jié)構(gòu)可以聚集更多的蛋白。這些蛋白可能包括骨誘導(dǎo)蛋白，可以通過(guò)影響細(xì)胞的黏附、增殖和分化促進(jìn)成骨。另一方面膠原作為交聯(lián)劑，它的螺旋形結(jié)構(gòu)為組織的再生創(chuàng)造了最為合適的微環(huán)境。

為了促進(jìn)骨愈合，近年來(lái)又有學(xué)者進(jìn)行了很多研究[11,12]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，微創(chuàng)理念逐步深入人心，在臨床治療中引入微創(chuàng)技術(shù)無(wú)疑有很好的前景。而延長(zhǎng)區(qū)注射液態(tài)Alg/ nHAC可有效的促進(jìn)牽拉成骨，并且創(chuàng)傷較小，有希望應(yīng)用于臨床，解決骨干截骨進(jìn)行延長(zhǎng)愈合差的難題，從而減少了骨干骺端固定困難、對(duì)鄰近關(guān)節(jié)所致不良干擾等并發(fā)癥。

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The experimental study on promoting the Ilizarov distraction osteogenesis by the injectiong of liquid Alg/nHAC biocomposites

Zhu Chao1,Wang Hua1,Liu Wei1,et al.
1 Department of Orthropaedics,Jiangning Hospital of Nanjing affiliated to Nanjing Medical University,Nanjing Jiangsu,211100;2 Department of Material Science and Engineering,Tisinghua University,Beijing,10081,China

Objective To investigate the effect of liquid sodium alginate/nanohydroxyapatite/collagen(Alg/nHAC)on promoting thehealingprocessof bonelengthening.Methods Alg/nHACinjectable artificialbone was fabricatedbyusing nano technology,and Animal model of rabbit tibia limbs,elongation were produced.All animals were randomly divided into two groups.After the end of the extension,liquid Alg/nHAC was injected into group A in the region of elongation. Group B were not given any treatment as control.Histologically morphological observations,X-ray examination,biomechanical test,bone density,and biomechanical test were used to evaluate the bone healing of extention area at 2,4 and 8 weeks after termination of bone elongation.Results Group A were better than Group B in histologically morphological observations,X-ray examination,biomechanical test,bone density,and biomechanical test at 2,4 and 8 weeks after termination of bone elongation.Group A bone elongation area has healed at 8 weeks after termination of bone elongation.Conclution Liquid alginate/nanohydroxyapatite/collagen(Alg/nHAC)can promote bone healing of extended area by minimally invasive injection.It provides a new method to promote bone healing in clinical.

Alg/nHAC; Ilizarov;Bone healing

R318

B

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.06.02

swgk2016-07-00167

朱超（1982-）男，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：骨科。

*[通訊作者]劉新輝（1971-）男，博士，主任醫(yī)師。研究方向：骨科。

2016-07-20)

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目BK20141436

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京江寧醫(yī)院骨科，江蘇南京211100；2清華大學(xué)材料科學(xué)與工程系北京100081