VEGF、EGFR、PDGF在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與惡性程度和預(yù)后的關(guān)系

李連進(jìn)，佟建洲，崔敬，吳紅紀(jì)，王惠賓

(保定市第一中心醫(yī)院神經(jīng)外二科，河北 保定 071000)

VEGF、EGFR、PDGF在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與惡性程度和預(yù)后的關(guān)系

李連進(jìn)，佟建洲，崔敬，吳紅紀(jì)，王惠賓

(保定市第一中心醫(yī)院神經(jīng)外二科，河北 保定 071000)

目的 探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與腫瘤惡性程度和患者預(yù)后的關(guān)系。方法選取我院神經(jīng)外科2010年11月至2013年8月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本68例及同期正常腦組織標(biāo)本12例，采用SP免疫組化法檢測(cè)所有標(biāo)本中VEGF、EGFR、PDGF的表達(dá)，分析其與膠質(zhì)瘤各臨床特征的關(guān)系，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析方法分析VEGF、EGFR、PDGF三者間的關(guān)系。結(jié)果膠質(zhì)瘤組織中VEGF、EGFR和PDGF的表達(dá)陽(yáng)性率分別為63.24%(43/68)、51.47%(35/68)和52.94%(36/68)，均明顯高于正常腦組織的0(0/12)、8.33%(1/12)和33.33%(4/12)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；在生存率方面，VEGF陽(yáng)性患者低于VEGF陰性患者(23.26%vs 60.00%)，EGFR陽(yáng)性患者低于EGFR陰性患者(28.57%vs 51.52%)，PDGF陽(yáng)性患者低于PDGF陰性患者(27.78%vs 62.50%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，VEGF、EGFR及PDGF的表達(dá)與膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)呈顯著正相關(guān)(rVEGF=0.428，rEGFR=0.407，rPDGF=0.431，P＜0.05)。結(jié)論VEGF、EGFR、PDGF在人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用，可作為判斷膠質(zhì)瘤惡性程度和預(yù)后的重要生物學(xué)參考指標(biāo)。

膠質(zhì)瘤；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；表皮生長(zhǎng)因子受體；血小板衍生生長(zhǎng)因子；預(yù)后；相關(guān)性

膠質(zhì)瘤是一種高度血管化的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)生和發(fā)展與微血管形成密切相關(guān)。病理情況下腫瘤細(xì)胞釋放出多種成血管因子誘導(dǎo)微血管形成，腫瘤組織經(jīng)微血管從宿主獲取養(yǎng)分，同時(shí)經(jīng)微血管轉(zhuǎn)送腫瘤細(xì)胞至宿主身體的其他部位，繼續(xù)生長(zhǎng)和誘導(dǎo)新的微血管形成，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)均在腫瘤血管生成中發(fā)揮著重要作用，其中VEGF是腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)微血管形成過(guò)程中的一個(gè)最重要的調(diào)節(jié)因子，參與了血管形成的全過(guò)程；EGFR是一種具有酪氨酸蛋白激酶活性的細(xì)胞膜受體，其與配體生長(zhǎng)因子結(jié)合后自身磷酸化激活，進(jìn)而通過(guò)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖[2]，最終促進(jìn)血管生成；而PDGF是一種旁分泌生長(zhǎng)因子，可通過(guò)自分泌及旁分泌作用刺激間質(zhì)增生和微血管生成，與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究通過(guò)檢測(cè)人腦膠質(zhì)瘤組織中VEGF、EGFR、PDGF的表達(dá)并與正常腦組織進(jìn)行比較，分析其與腫瘤惡性程度和預(yù)后的關(guān)系，以期為膠質(zhì)瘤抗血管生成治療及生物免疫治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院神經(jīng)外科2010年11月至2013年8月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本68例，患者術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療及生物免疫治療等輔助治療。其中男性39例，女性29例，年齡22～76歲，平均(42.76±6.49)歲。所有標(biāo)本經(jīng)常規(guī)組織病理學(xué)檢查，其中確診為星形細(xì)胞瘤36例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤24例，少突星形和毛細(xì)胞形細(xì)胞瘤各4例。按照2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[3]分級(jí)：Ⅰ級(jí)4例、Ⅱ級(jí)28例、Ⅲ級(jí)25例、Ⅳ級(jí)11例。12例正常人腦組織來(lái)源于腦外傷行去骨瓣減壓手術(shù)患者，設(shè)為正常對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 (1)儀器：全自動(dòng)封閉型組織脫水機(jī)、石蠟切片機(jī)(德國(guó)SLEE)，倒置光顯微鏡、顯微鏡成像系統(tǒng)(日本OLYMPUS)，烤箱及孵箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司)；(2)試劑：鼠抗人VEGF單克隆抗體(1:300)、鼠抗人EGFR單克隆抗體(1:200)、鼠抗人PDGF單克隆抗體(1:300)及通用型SP廣譜試劑盒、DAB顯色劑(ZLI-9031)、磷酸鹽緩沖液(PBS)，均購(gòu)自上海億新生物科技有限公司，均購(gòu)自上海億欣生物科技有限公司。

1.2.2 SP免疫組化染色法 將所有組織標(biāo)本采用10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，行4 μm連續(xù)切片。石蠟切片脫蠟至水，加入3%H2O2，37℃孵育10 min，PBS沖洗3次，5 min/次。微波抗原熱修復(fù)，加入50 μL牛血清白蛋白封閉液(BSA)封閉，置于37℃孵育，傾去勿洗。10 min滴加VEGF、EGFR、PDGF一抗(1:50稀釋)，4℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，5 min/次。滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育40 min，PBS沖洗3次，5 min/次；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次；DAB顯色3～5 min，自來(lái)水充分沖洗；蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片，顯微鏡下觀察。操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 結(jié)果判定 VEGF表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒；EGFR表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒；PDGF表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。高倍視野下(×400)隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞百分率＜10%為0分；10%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕色或棕褐色為3分。以計(jì)分和染色強(qiáng)度評(píng)分乘積＞4分定義為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)經(jīng)核對(duì)證實(shí)后均經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析方法分析VEGF、EGFR及PDGF的表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中VEGF、EGFR及PDGF的表達(dá)差異 VEGF在正常腦組織中不表達(dá)，EGFR及PDGF在正常腦組織中低表達(dá)，VEGF、EGFR及PDGF均在人腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)。人腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中VEGF、EGFR及PDGF的表達(dá)陽(yáng)性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 人腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中VEGF、EGFR及PDGF的表達(dá)陽(yáng)性率的比較[例(%)]

2.2 VEGF、EGFR及PDGF的表達(dá)與人腦膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)的相關(guān)性 VEGF、EGFR及PDGF在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)陽(yáng)性見(jiàn)表2和圖1。結(jié)果顯示，VEGF、EGFR及PDGF的表達(dá)陽(yáng)性率隨腫瘤分級(jí)的升高呈上升趨勢(shì)，以在Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率最高，其次為Ⅲ級(jí)，再次為Ⅱ級(jí)，最低為Ⅰ級(jí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2VEGF=8.104，χ2EGFR=7.948，χ2PDGF= 6.774，P＜0.05)。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，VEGF、EGFR及PDGF的表達(dá)與膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)呈顯著正相關(guān)(rVEGF=0.428，rEGFR=0.407，rPDGF=0.431，P＜0.05)。

2.3 VEGF、EGFR及PDGF表達(dá)與患者生存的關(guān)系 VEGF、EGFR及PDGF表達(dá)陽(yáng)性及陰性的生存曲線分析見(jiàn)圖2。VEGF(23.26%)、EGFR(28.57%)及PDGF(27.78%)表達(dá)陽(yáng)性患者累積生存率明顯低于表達(dá)陰性患者(60.00%、51.52%、62.50%)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 VEGF、EGFR及PDGF在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)[例(%)]

圖1 VEGF、EGFR及PDGF在WHOⅡ級(jí)和Ⅳ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

圖2 VEGF、EGFR及PDGF表達(dá)陽(yáng)性及陰性的生存曲線

3 討 論

微血管生成在實(shí)體瘤生長(zhǎng)和發(fā)展中起重要作用，若實(shí)體瘤內(nèi)無(wú)微血管形成，腫瘤僅可以通過(guò)擴(kuò)散緩慢生長(zhǎng)，一旦形成微血管，腫瘤即呈指數(shù)型快速生長(zhǎng)并進(jìn)一步向周圍浸潤(rùn)和進(jìn)入血循環(huán)向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展具有血管依賴性[4]。而腦膠質(zhì)瘤是一種高度血管化的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤,微血管生成是其生長(zhǎng)和侵襲過(guò)程中的重要階段。無(wú)控性增殖、侵襲性生長(zhǎng)等特性導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤臨床治愈率低，預(yù)后差，是神經(jīng)外科治療中最棘手的難治性腫瘤之一[5]。近年來(lái)，隨著分子靶向治療研究的不斷深入，針對(duì)腦膠質(zhì)瘤微血管生成因子或受體的分子靶向治療已成為研究的熱點(diǎn)之一[6]。

VEGF、EGFR、PDGF均在腫瘤微血管生成中發(fā)揮重要作用，項(xiàng)高波等[7]研究顯示，膠質(zhì)瘤組織中VEGF的表達(dá)與腫瘤微血管密度呈明顯正相關(guān)，其表達(dá)高水平可反映腫瘤微血管生成呈高度活躍。Wang等[8]研究報(bào)道，惡性膠質(zhì)瘤中常出現(xiàn)EGFR擴(kuò)增和過(guò)度表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加快微血管生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。劉愛(ài)軍等[9]研究報(bào)道，PDGF可與VEGF相互作用，通過(guò)自分泌及旁分泌作用刺激間質(zhì)增生和微血管生成，從而有利于腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，已有多項(xiàng)研究證實(shí)，通過(guò)阻斷VEGF、EGFR、PDGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可抑制腫瘤微血管形成，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的[10-11]。因此，檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織中VEGF、EGFR、PDGF是否為異常表達(dá)對(duì)評(píng)估VEGF、EGFR、PDGF作為腦膠質(zhì)瘤分子靶向治療的靶點(diǎn)的可行性具有較重要的臨床意義。本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)68例腦膠質(zhì)瘤組織和12例正常腦組織標(biāo)本中VEGF、EGFR、PDGF的表達(dá)情況，并分析其與腦膠質(zhì)瘤惡性程度和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，人腦膠質(zhì)瘤組織中VEGF、EGFR、PDGF表達(dá)陽(yáng)性率均明顯高于正常腦組織，且三者在不同分級(jí)的膠質(zhì)瘤中的表達(dá)具有較大差異，隨著膠質(zhì)瘤分級(jí)增高，三者在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)陽(yáng)性率上升，相關(guān)性分析顯示VEGF、EGFR、PDGF的表達(dá)與膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)呈明顯的相關(guān)性，且VEGF、EGFR、PDGF表達(dá)陽(yáng)性的患者的生存率明顯低于表達(dá)陰性者。表明VEGF、EGFR、PDGF在膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，且與膠質(zhì)瘤惡性程度呈明顯正相關(guān)，與膠質(zhì)瘤惡性程度越高、浸潤(rùn)越明顯、預(yù)后越差的臨床屬性相符合，可作為判斷膠質(zhì)瘤惡性程度和預(yù)后的重要生物學(xué)參考指標(biāo)。此外，VEGF、EGFR、PDGF在腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，而在正常腦組織中低表達(dá)或無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，提示VEGF、EGFR、PDGF可作為腦膠質(zhì)瘤分子靶向治療的靶點(diǎn)。

綜上所述，EGF、EGFR、PDGF在人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用，三者共同參與促進(jìn)微血管形成的作用。VEGF、EGFR、PDGF的表達(dá)可作為判斷膠質(zhì)瘤惡性程度和預(yù)后的重要生物學(xué)參考指標(biāo)，針對(duì)VEGF、EGFR、PDGF為靶點(diǎn)的腦膠質(zhì)瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)干預(yù)治療有待進(jìn)一步的研究，有望通過(guò)抗膠質(zhì)瘤微血管生成達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。

[1]Jhaveri N,Chen TC,Hofman FM.Tumor vasculature and glioma stem cells:Contributions to glioma progression[J].Cancer Lett, 2014,16(14):783-786.

[2]唐天友,許瑩瑩,王建設(shè),等.人腦膠質(zhì)瘤組織MGMT和EGFR及Ki-67表達(dá)臨床意義分析[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(11): 840-844.

[3]Rychly B,Sidlová H,Dani? D.The 2007 World Health Organisation classification of tumours of the central nervous system,comparison with 2000 classification[J].Cesk Patol,2008,44(2):35-36.

[4] Sun H,Guo D,Su Y,et al.Hyperplasia of pericytes is one of the main characteristics of microvascular architecture in malignant glioma[J].PLoS One,2014,9(12):e114246.

[5]楊群英,沈冬,賽克,等.初診惡性腦膠質(zhì)瘤患者綜合治療的生存情況分析[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2013,93(1):8-10.

[6]Khasraw M,Ameratunga MS,Grant R,et al.Antiangiogenic therapy for high-grade glioma[J].Cochrane Database Syst Rev,2014,9: CD008218.

[7]項(xiàng)高波,鄧勇,鮑風(fēng),等.IL-24與VEGF在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)以及與腫瘤微血管密度的關(guān)系[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,48(7): 810-813.

[8]Wang S,Zhao Y,Ruan Z,et al.Association between EGF+61 G/A and glioma risk in a Chinese population[J].BMC Cancer,2010,10: 221.

[9]劉愛(ài)軍,王樹(shù)偉,徐翔,等.血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、血清反應(yīng)因子(SRF)和波形蛋白在人腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)的臨床意義[J].復(fù)旦學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2014,41(1):111-114.

[10]李燾,王雄偉.EGFR及其下游通路在膠質(zhì)瘤治療中的研究進(jìn)展[J].癌癥防治研究,2011,38(10):1204-1206.

[11]Gressot LV,Doucette TA,Yuhui Y,et al.Signal transducer and activator of transcription 5b drives malignant progression in a PDGFB-dependent proneural glioma model by suppressing apoptosis[J].International Journal of Cancer,2015,136(9):2047-2054.

Expression and its relationship with the degree of malignancy and prognosis of VEGF,EGFR and PDGF in human brain gliomas.

LI Lian-jin,TONG Jian-zhou,CUI Jing,WU Hong-ji,WANG Hui-bin.Department of Neurosurgery,Baoding First Central Hospital,Baoding 071000,Hebei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression and its relationship with the degree of malignancy and prognosis of vascular endothelial growth factor(VEGF),epidermal growth factor receptor(EGFR),platelet derived growth factor(PDGF)in human gliomas.MethodsSixty-eight samples of brain glioma confirmed by pathology and 12 samples of normal brain tissue in Department of Neurosurgery in our hospital from November 2010 to August 2008 were selected.The SP immunohistochemical method was used to detect the expression of VEGF,EGFR and PDGF in all specimens,and analyzed the relationship between the expression of VEGF,EGFR,PDGF and the malignancy of glioma. The relationship between VEGF,EGFR and PDGF was analyzed by Spearman rank correlation analysis.ResultsThe expression positive rates of VEGF,EGFR and PDGF in glioma tissue were significantly higher than those in normal brain tissues[63.23%(43/68)vs 0(0/12),51.47%(35/68)vs 8.33%(1/12),52.94%(36/68)vs 33.33%(4/12),P＜0.05].In terms of survival,the VEGF positive rates were significantly lower than VEGF negative(23.26%vs 60.00%),and EGFR positive rates were significantly lower than the EGFR negative(28.57%vs 51.52%),PDGF positive rates were significantly lower than PDGF negative(27.78%vs 62.50%,P＜0.05).Spearman rank correlation analysis showed that the expression of VEGF,EGFR and WHO was significantly positively correlated with the WHO grading of gliomas(rVEGF=0.428,rEGFR=0.407，rPDGF=0.431,P＜0.05).ConclusionVEGF,EGFR,PDGF play an important role in the occurrence and development of human glioma.It can be used as an important biological reference index to judge the degree of malignancy and prognosis of gliomas.

Glioma;Vascular endothelial growth factor(VEGF);Epidermal growth factor receptor(EGFR); Platelet derived growth factor(PDGF);Prognosis;Relationship

R687.4

A

1003—6350（2016）14—2251—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.14.006

2016-01-27)

李連進(jìn)。E-mail：6653879@qq.com